لا غنى عن نماذج الإصابة لدراسة التجدد في الجسم الحي ، ومع ذلك ، ثبت أن التحقيق في التجدد في الأمعاء يمثل تحديا تقنيا. أدى الافتقار إلى بروتوكولات التصوير الطولي إلى منع رؤية أعمق لديناميكيات مقياس الخلايا والأنسجة التي تنظم تجديد الأمعاء. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة الفحص المجهري داخل الجسم التي تحفز محليا تلف الأنسجة على نطاق سرداب واحد ، وتتبع الاستجابة التجديدية لظهارة الأمعاء في الفأر الحي لتلف الاجتثاث بالليزر القائم على الفوتون من سرداب واحد أو حقول معوية أكبر بطريقة يتم التحكم فيها في الزمان والمكان.
يتيح التصوير اللاحق والطويل الأجل والمتكرر داخل الجسم تتبع المنطقة المتضررة بمرور الوقت ، ويسمح بمراقبة ديناميكيات القبو أثناء استعادة الأنسجة على مدى عدة أسابيع. حث الفئران عن طريق حقن عقار تاموكسيفين المذاب في زيت عباد الشمس في أربعة إلى ستة أسابيع قبل الجراحة. تطبيق تسكين ، حقن 200 ميكرولتر من البوبرينورفين تحت الجلد قبل 30 دقيقة من الجراحة.
تطبيق الكاربروفين في مياه الشرب قبل 24 ساعة من الجراحة. إدخال أدوات جراحية معقمة معقمة في خزانة المخاطر البيولوجية. قم بتشغيل وسادة التدفئة ، واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
قم بتشغيل غرفة التحكم في درجة حرارة المجهر قبل أربع ساعات على الأقل من التصوير. حافظ على درجة الحرارة داخل غرفة المناخ مستقرة عند 37 درجة مئوية. قم بتشغيل مجهر الفوتون والماسح الضوئي والليزر.
قم بتشغيل برنامج التصوير. اضبط الطول الموجي لليزر على 960 نانومتر وافتح الغالق. تخدير الماوس باستخدام اثنين إلى 3٪ إيزوفلوران ، ووضعه على وسادة تدفئة مغطاة بقطعة قماش معقمة.
تحقق من عمق التخدير من خلال تقييم تواتر وجودة التنفس نفسا واحدا في الثانية ، وعن طريق التحقق من رد فعل الماوس. تغطية عيون الماوس مع مرهم العين. حقن 200 ميكرولتر من المياه المالحة المعقمة قبل التسخين تحت الجلد.
حلق البطن وإزالة الشعر. تغيير قطعة القماش المعقمة في منطقة الجراحة. أدخل مسبار المستقيم لمراقبة درجة حرارة الماوس.
يجب أن تكون درجة الحرارة حوالي 37 درجة مئوية. ارتد زوجا جديدا من القفازات المعقمة. نظف المنطقة الجراحية بطريقة دائرية باستخدام مقشرات متناوبة من محلول مطهر متبوعة ب 80٪ إيثانول ثلاث مرات.
تغطية الماوس مع ستارة جراحية معقمة. تحقق من رد فعل الماوس. قم بعمل شق عمودي في خط الوسط بطول 10 ملم عبر الجلد باستخدام مشرط معقم.
شق خط ألبا باستخدام المقص لفصل عضلات البطن المستقيمة وفتح البطن. ابحث عن الأعور للفأر باستخدام قطعة قطن معقمة مبللة بمحلول ملحي تم تسخينه مسبقا لاستخدامه كنقطة مرجعية. اصنع قطعا صغيرا في قطعة من الشاش ، بللها في محلول ملحي معقم مسخن مسبقا ، وضعه فوق الشق.
أخرج الأمعاء بمسحات قطنية معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم تم تسخينه مسبقا. حافظ على رطوبة الأمعاء عن طريق إضافة محلول ملحي معقم تم تسخينه مسبقا. انقل الماوس إلى صندوق تصوير معقم مسخن مسبقا.
ضع الأمعاء على الزجاج المعقم. ضع رأس الماوس داخل أنبوب الاستنشاق في صندوق التصوير. إذا لزم الأمر ، قم بتأمين الماوس بفيلم وشريط مرن معقمين.
ضع صندوق التصوير الذي يحتوي على الماوس في غرفة المجهر. راقب الماوس أثناء التصوير عن طريق التحقق من تواتر وعمق التنفس ودرجة الحرارة عبر مسبار المستقيم كل 15 دقيقة. يجب أن تبقى إيزوفلوران بين واحد إلى 2٪ابحث عن منطقة في الأمعاء باستخدام عناوين IP للمجهر.
احصل على رؤية ميدانية واسعة للمنطقة محل الاهتمام باستخدام الكاميرا الداخلية للمجهر. تخيل منطقة الاهتمام باستخدام ليزر 960 نانومتر للمجهر متعدد الفوتونات. ضبط قوة الليزر والطول الموجي وفقا للأشكال الفلورية المستخدمة في التجربة.
في هذا المثال ، الخبايا المعبر عنها الغشاء هي بروتين الفلورسنت الأحمر ، ويتم تمييزها عشوائيا ببروتين الفلورسنت الأخضر عند الحث بجرعة نهائية منخفضة من عقار تاموكسيفين. احصل على مكدس Z من 10 إلى 20 خطوة من ثلاثة ميكرون من المنطقة محل الاهتمام. اختر موضع واحد أو مواضع متعددة من صورة التجانب سابقا.
استخدم وظيفة معايرة نقطة الخرق في برنامج التصوير عند التكبير / التصغير 32 ودقة 124 × 124 بكسل مع سرعة مسح 400 هرتز باستخدام خاصية المسح ثنائي الاتجاه لمدة ثلاث إلى 10 ثوان ، اعتمادا على حجم الضرر المستهدف. يمكن التعرف على بدء الضرر في منطقة القبو من خلال زيادة التألق الذاتي في كل من القناة الخضراء والحمراء. بعد الاجتثاث ، احصل على مداخن Z للمناطق المتضررة لتأكيد الموقع ومدى الضرر.
كرر الخطوتين السابقتين لمناطق متعددة في نفس الماوس. ضع الفأر وهو لا يزال تحت التخدير على منطقة خياطة معقمة وقم بتغطيته بستارة معقمة. أدخل الأمعاء المكشوفة مرة أخرى في البطن باستخدام مسحات قطنية معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم مسخن مسبقا.
خياطة خط ألبا عن طريق إجراء خياطة مستمرة بسيطة باستخدام خياطة قابلة للامتصاص. أغلق أطراف الخيط بعقدة جراحية. كرر نفس الخطوة مع طبقة الجلد.
قم بإيقاف تشغيل محطة isoflurane ، وقم بتنظيف وتعقيم صندوق التصوير والبطانة. دع الفأر يتعافى من الجراحة أثناء وضع القفص على وسادة التدفئة لمدة ساعة واحدة. حقن 200 ميكرولتر من البوبرينورفين تحت الجلد بعد ست إلى 12 ساعة من الجراحة.
تطبيق الكاربروفين في مياه الشرب لمدة 72 ساعة بعد الجراحة. وزن الماوس ومراقبة الرفاهية كل يوم لمدة أسبوع واحد بعد الجراحة. في النقطة الزمنية الثانية بعد أسبوع واحد على الأقل من جلسة التصوير الأولى ، كرر الجراحة والتصوير داخل الجسم.
استخدم نمط الأوعية الدموية للعثور على صورة المناطق نفسها موضع الاهتمام في النقطة الزمنية الأولى. إذا لم يكن من المفترض تصوير الفأر في نقطة زمنية أخرى ، فقم بالتضحية بالفأر عن طريق إجراء خلع عنق الرحم تحت التخدير. خلاف ذلك ، استمر في إغلاق موقع الجراحة والرعاية بعد الجراحة.
تم حقن الفئران K19-Cre ERT mTmG بعقار تاموكسيفين للحث على وضع العلامات العشوائية للخلايا باستخدام GFP قبل أربعة إلى ستة أسابيع من الجراحة وجلسة التصوير الأولى. بعد تعريض أمعاء الفأر جراحيا والحصول على صور الكاميرا والفلورسنت للمنطقة محل الاهتمام ، يتم استخدام إعدادات نقطة الخرق لليزر متعدد الفوتونات لاستئصال الخبايا. يمكن التعرف على بدء الضرر من خلال زيادة التألق الذاتي في كل من القناة الخضراء والحمراء.
يتم تكرار نفس الإجراء بعد شهر واحد ، ويتم استخدام الأوعية الدموية كمعلم للعثور على نفس المنطقة. باستخدام نموذج قصاصات الورق Lgr5-eGFP ، يمكن متابعة الخبايا الموسومة بألوان مختلفة بمرور الوقت لتعيين ديناميكيات الاسترداد. في هذا المثال ، تعبر الخبايا باللون الأخضر عن Lgr5 Cre ، ويتم تمييز سرداب باللون الأرجواني بلون قصاصات الورق.
لوحظت طرق مختلفة للتجديد بعد أسبوعين من الاجتثاث بالليزر. تظل بعض المناطق دون تغيير ، بينما تظهر مناطق أخرى إعادة تشكيل في أشكال انشطار القبو ، وبالتالي فإن تقسيم سرداب واحد إلى اثنين ، أو الاندماج ، أو دمج سردبين في واحد ، أو اختفاء السرداب. الاجتثاث بالليزر جنبا إلى جنب مع طريقة الفحص المجهري داخل الجسم يحد من الضرر الذي يلحق بمنطقة محددة من الاهتمام.
يتيح لنا ذلك التحكم في موقع الضرر وكذلك مدى الضرر. يمكن تعديل شدة الضرر لاستئصال الخبايا أو الحقول المعوية بأكملها لإبلاغنا بالاستجابة التجديدية على نطاق السرداب. بالإضافة إلى التحكم المكاني ، يسمح الاجتثاث بالليزر أيضا بتحديد وقت ظهور الضرر بدقة بالإضافة إلى تصوير نفس العضو في ظل ظروف الاستتباب والتجديد في نفس الماوس ، وبالتالي تجاوز دقة نماذج الإصابة السابقة.
يمكن استخدام تطبيق الاستئصال بالليزر والتصوير المتكرر داخل الجسم كمنصة للعديد من الأسئلة البحثية والمجالات العلمية المتنوعة التي تشمل التجديد وعلم المناعة وأبحاث السرطان.
