يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتحديد ما إذا كان نشاط الكاسباز يحدث بالتزامن مع موت الخلايا ، وبالتالي تحديد أنماط مختلفة من موت الخلايا. ميزة هذه التقنية هي المرونة في تقييم نشاط الكاسباز في مقايسة سكانية أو خلية واحدة. سيوضح الإجراء ستيفاني روفلي ، خريجة الدكتوراه ، وجينغ تونغ ، طالبة دكتوراه زائرة من مختبر ويندي وي لين وونغ.
بعد تمييز وحصاد البلاعم المشتقة من نخاع العظم أو BMDMs كما هو موضح في المخطوطة ، قم ببذرها في صفيحة من ستة آبار بكثافة واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. علاج الخلايا مع محاكاة SMAC لمدة 16 ساعة. لتحضير محللة الخلية ، انقل الصفيحة التي تحتوي على خلايا معالجة على الجليد واجمع وسط زراعة الخلية في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي عند 300 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. نضح الوسط ووضع الأنبوب على الجليد. ثم أضف ملليلتر واحد من PBS البارد إلى لوحة زراعة الخلايا لغسل الخلايا.
بعد استنشاق جميع PBS ، أضف 100 ميكرولتر من التربسين إلى الخلايا. بمجرد فصل الخلايا عن اللوحة ، اجمعها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. بعد الطرد المركزي لتعليق الخلية ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مخزن تحلل القرص سعة 100 ميكرولتر.
احتضان العينة على الثلج لمدة 20 دقيقة ثم قم بالطرد المركزي للمحلول لتكوير الجزء غير القابل للذوبان. انقل 25 ميكرولترا من المحللة إلى صفيحة بيضاء مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا لمقايسة نشاط caspase-3/7 و 10 ميكرولتر إلى صفيحة شفافة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا لحمض البيسينشونيك أو مقايسة BCA. لتحديد كمية البروتين ، قم بإعداد مجموعة من ألبومين مصل الأبقار أو تركيزات BSA كبروتين قياسي.
بمجرد إضافة BSA القياسي إلى لوحة 96 بئر مسطحة القاع تحتوي على العينات ، امزج كواشف BCA واحد واثنين بنسبة 50 إلى واحد وأضف 200 ميكرولتر منها إلى كل عينة في المعيار. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر على أداة قياس الفلورومتر وحدد تركيز البروتين بالمنحنى القياسي. لإجراء فحص قائم على السكان ، ابدأ تشغيل أداة القياس الفلوري وقم بتسخين الماكينة إلى 30 درجة مئوية.
اضبط الطول الموجي للإثارة والانبعاث على 360 و 465 نانومتر على التوالي. ثم قم بإعداد مزيج تفاعل رئيسي على الجليد كما هو موضح في المخطوطة لتحديد نشاط الكاسباز. أضف 75 ميكرولترا من المزيج إلى كل عينة ومعيار للحصول على حجم تفاعل إجمالي قدره 100 ميكرولتر.
قم بقياس التألق على الفور باستخدام إعداد أداة القياس الفلوري وسجل القراءات الفردية كل دقيقة لمدة 40 دقيقة لتحديد حركية التفاعل. بعد البذر ، احصد الخلايا الملتصقة كما هو موضح سابقا في أنبوب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر. ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 300 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية.
لتحضير مزيج التلوين ، خذ ميكرولترا واحدا من الركيزة الفلوروجينية وقم بتخفيفه ب 150 ميكرولتر من PBS. أضف 50 ميكرولتر من مزيج التلوين لكل عينة ، واحتضنها في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة واخلطها كل 15 دقيقة. في هذا الفحص القائم على السكان ، أظهرت البيانات التمثيلية للمقايسة الحركية لنشاط caspase-3/7 زيادة في انقسام الركيزة مع زيادة تركيز محاكاة SMAC.
ومع ذلك ، كانت الزيادة عند تركيز 500 نانومولار ضئيلة بناء على ANOVA عادي أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة. أشار تحليل نشاط caspase-3/7 باستخدام قياس التدفق الخلوي إلى حدوث تحول في التألق للخلايا المعالجة بمحاكاة SMAC مقارنة بالخلايا غير المعالجة ، والتي كانت واضحة أيضا في متوسط شدة التألق المخطط وكانت الزيادة عند تركيز 500 نانومولار كبيرة. يجب تنفيذ الإجراء على الجليد.
ومع ذلك ، في الفحص القائم على السكان ، لا يمكن ترك العينات على الجليد إلى أجل غير مسمى. بعد خطوة التحلل ، يجب معالجة العينات أو تجميدها على الفور. سيكون تصوير نشاط الكاسباز باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية طريقة إضافية للحصول على معلومات حركية على مستوى خلية واحدة.
