تعد الكائنات الحية الدقيقة المكونة للغشاء الحيوي قضية رئيسية في صناعة الأغذية ، بما في ذلك صناعة الألبان. بسبب تأثيرها السلبي على جودة المنتجات ، من المهم تطوير استراتيجيات مراقبة الأغشية الحيوية. يجمع هذا النهج بين طريقة فحص ثابتة عالية الإنتاجية وطريقة ديناميكية تحاكي الظروف في الموقع.
هاتان الطريقتان متكاملتان لدراسة فعالية المطهرات ضد الأغشية الحيوية. يمكن استخدام هذا النهج لاختبار تركيبات بيولوجية أو كيميائية جديدة للتحكم في الأغشية الحيوية في القطاعات الغذائية أو الطبية أو البيئية. ابدأ بدوامة أنابيب الثقافة البكتيرية Pseudomonas azotoformans.
نقل 100 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية بشكل معقم إلى 10 ملليلتر من مرق الصويا التربتي المعقم أو وسط TSB لتحقيق التركيز النهائي لما يقرب من مرتين 10 إلى CFU السابع لكل ملليلتر. دوامة أنبوب الثقافة. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بنقل 150 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية المخففة في آبار لوحة العيار الدقيق للغشاء الحيوي في ثلاث نسخ.
تحميل 150 ميكرولتر من وسط TSB في ثلاثة آبار جديدة كتحكم. بعد ذلك ، احتضان لوحة المعايرة الدقيقة للغشاء الحيوي عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة دون تحريك. نظف أجزاء المفاعل الحيوي وجففها في الهواء قبل وضع الشفرة المسطحة داخل دورق زجاجي سعة لتر واحد متصل بالحامل بواسطة قضيب مغناطيسي.
حافظ على الإعداد في وضع مستقيم باستخدام القضيب البلاستيكي المتصل بالجانب الداخلي لغطاء المفاعل الحيوي. استخدم مفك البراغي لوضع كوبونات أو شرائح من الفولاذ المقاوم للصدأ على قضبان البولي بروبلين. أدخل القسائم أو الشرائح في الثقوب الموجودة في الغطاء دون وضع دبابيس المحاذاة الخاصة بها في الشقوق مما يسمح للبخار بالخروج أثناء التعقيم.
قم بتغطية جميع فتحات المفاعل الحيوي بورق الألمنيوم ولف بقية المعدات ، وهي أنابيب الحجم 18 وأنابيب الحجم 16 ، وفرامل التدفق الزجاجي ، وأغطية الحاويات ، والمفكات ، والملقط ، ومرشحات 0.2 ميكرومتر بورق الألمنيوم. الأوتوكلاف المفاعل الحيوي الذي تم إعداده في دورة جافة عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لتنفيذ الخطوة الأولى من تكوين الأغشية الحيوية في المفاعل الحيوي في وضع الدفعات ، داخل خزانة أمان بيولوجي ، قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب بحجم 18 بفوهة مخرج المفاعل الحيوي واحتفظ بالطرف الآخر ملفوفا بورق الألمنيوم.
قم بإزالة قسيمة واحدة أو حامل منزلق من غطاء المفاعل الحيوي وضعه في أنبوب معقم سعة 50 ملليلتر. ثم باستخدام ماصة مصلية 50 ملليلتر ، املأ دورق المفاعل الحيوي ب 340 ملليلتر من 300 ملليغرام لكل ملليلتر TSB وسط من خلال الفتحة التي يشغلها القضيب. لتلقيح وسط الاستزراع في المفاعل الحيوي ، أضف ملليلترا واحدا من 10 إلى CFU الثامن لكل مليلتر محلول بكتيري Pseudomonas azotoformans من خلال الفتحة باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر ووضع القضيب مرة أخرى في موضعه الأصلي.
ضع القضبان الموضوعة بالفعل في فتحات الغطاء حتى تتناسب المسامير مع الشقوق المعنية. ثم ضع مرشح تطهير الهواء البكتيري 0.2 ميكرومتر في نهاية أصغر أنبوب قطر يقع على غطاء المفاعل الحيوي. يظل الأنبوب الآخر من نفس القطر متصلا بشكل دائم بغطاء لولبي معدني أو سدادة سيليكون تغلق بإحكام.
ضع المفاعل الحيوي لمدة 24 ساعة فوق لوحة التسخين المحددة عند 30 درجة مئوية وحركها عند 130 دورة في الدقيقة. بعد 24 ساعة ، قم بإجراء الخطوة الثانية من تكوين الأغشية الحيوية في المفاعل الحيوي في وضع التدفق المستمر. ضع كاربوي يحتوي على 18 لترا من الماء المقطر المعقم في خزانة السلامة الحيوية.
ثم أضف لترين من 1000 ملليغرام لكل لتر وسط استزراع TSB للحصول على تركيز نهائي قدره 100 ملليغرام لكل لتر. قم بتغطية الحاوية بغطاءها المعقم الذي يتصل به أنبوبان. الأول هو أنبوب سيليكون مثبت على واجهة الغطاء لضخ الوسط.
والثاني يتم توصيل أنبوب بحجم 16 بالمنفذ الخارجي مما يسمح للسائل بالتدفق نحو المفاعل الحيوي. بعد توصيل أنبوب الحجم 16 بطرف فرامل التدفق الزجاجي ، أدخل الأخير في أكبر أنبوب على غطاء المفاعل الحيوي من طرفه الآخر ثم قم بتثبيت أنبوب الحجم 16 في المضخة التمعجية. استخدم كاربوي آخر سعة 20 لترا لجمع النفايات السائلة من المفاعل الحيوي.
قم بتوصيل نهاية الأنبوب المتصل بفوهة مخرج المفاعل الحيوي بغطاء حاوية النفايات. أدخل مرشح 0.2 ميكرومتر في الأنبوب الموجود على غطاء هذه الحاوية. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ابدأ تشغيل المضخة التمعجية بمعدل تدفق 11.3 ملليلتر في الدقيقة واترك النظام يعمل لمدة 24 ساعة.
بعد 24 ساعة ، قم بإيقاف تشغيل المضخة التمعجية وتوقف عن تحريك وتسخين المفاعل الحيوي. لاستعادة الغشاء الحيوي البكتيري ، اشطف القسائم أو الشرائح في 40 مل من برنامج تلفزيوني للقضاء على بكتيريا العوالق. ثم حررها في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر يحتوي على 40 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
بعد 30 ثانية من الدوامة ، صوتنة الأنابيب عند 40 كيلو هرتز لمدة 30 ثانية. كرر هذا ثلاث مرات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، اجمع 40 ملليلترا من معلق الأغشية الحيوية في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر واشطف القسائم أو الشرائح باثنين من محلول PBS المعقم.
استرجع سائل الشطف هذا وأضفه إلى تعليق الأغشية الحيوية الذي تم جمعه بالفعل. أخرج لوحة المعايرة الدقيقة من 30 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى ثلاثة آبار من صفيحة صغيرة من 96 بئرا.
لغسل الأغشية الحيوية والقضاء على بكتيريا العوالق ، انقل غطاء الصفيحة الدقيقة للغشاء الحيوي مع الأغشية الحيوية المتكونة على الأوتاد إلى الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على PBS لمدة 10 ثوان. تحضير المطهرات بالتركيزات المطلوبة وإضافة 200 ميكرولتر من كل تركيز مطهر في آبار صفيحة عيار 96 بئر جديدة في ثلاث نسخ. انقل غطاء صفيحة المعايرة الدقيقة للغشاء الحيوي إلى 96 صفيحة معايرة دقيقة تحتوي على المطهرات واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لوقت التعرض المطلوب.
بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من مرق تحييد Dey-Engley إلى آبار صفيحة عيار 96 بئرا جديدة. انقل غطاء صفيحة المعايرة الدقيقة للغشاء الحيوي إلى صفيحة المعايرة الدقيقة ذات 96 بئرا التي تحتوي على مرق التحييد. ختم لوحة microtiter مع parafilm ووضعها في سونيكاتور الحمام في 40 كيلو هرتز لمدة 30 دقيقة.
بعد 30 دقيقة ، من العمود الأول من اللوحة الصوتية ، قم بنقل 100 ميكرولتر من الأغشية الحيوية المنفصلة إلى الصف الأول من لوحة عيار ميكرو جديدة مكونة من 96 بئرا. ثم أضف 180 ميكرولترا من PBS المعقمة إلى لوحة 96 بئرا باستثناء الصف الأول. بعد ذلك ، قم بنقل 20 ميكرولترا من محلول الأغشية الحيوية من الصف الأول إلى الآبار في الصف الثاني التي تحتوي على 180 ميكرولترا من PBS لتحقيق التخفيف 10 إلى ناقص واحد.
ثم انقل 20 ميكرولترا من الصف الثاني إلى الآبار في الصف التالي لتحقيق تخفيف 10 إلى ناقص اثنين. كرر ذلك للحصول على تخفيف بين 10 أس سالب خمسة و10 أس سالب سبعة. تلقيح 100 ميكرولتر من التخفيف المطلوب على TSA واحتضان الألواح وفقا لمعايير نمو البكتيريا.
قم بتشكيل الأغشية الحيوية Pseudomonas azotoformans PFLA 1 على القسائم في المفاعل الحيوي ، وقم بإزالة القضيب الذي يحمل القسائم وشطف القضيب داخل أنبوب مخروطي يحتوي على 30 ملليلتر من PBS لإزالة خلايا العوالق. قم بإسقاط كل قسيمة في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر باستخدام مفك البراغي. ثم أضف أربعة ملليلتر من محلول البيروكسي العضوي المناسب أو PBS للتحكم.
بعد خمس دقائق من الحضانة ، أضف 36 ملليلتر من مرق تحييد Dey-Engley. بعد دوامة الأنبوب المخروطي لمدة 30 ثانية ، صوتنة لهم في 40 كيلو هرتز لمدة 30 ثانية. كرر العملية ثلاث مرات للحصول على تعليق الأغشية الحيوية.
كرر نفس الإجراء مع القضبان الأخرى ، وقم بإعداد الأوهام التسلسلية لتعليق الأغشية الحيوية ، وقم بلوحة التعليق على وسيط TSA كما هو موضح سابقا. أظهر تحليل SCM وجود الأغشية الحيوية بواسطة Pseudomonas azotoformans PFL1A على أوتاد الصفائح الدقيقة للغشاء الحيوي. بدا الغشاء الحيوي Pseudomonas azotoformans PFL1A الذي تم تشكيله على شريحة من الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام مفاعل حيوي كثيفا للغاية وأظهر الخصائص المورفولوجية لغشاء حيوي ثلاثي الأبعاد ناضج.
وأظهرت نتائج العد البكتيري للأغشية الحيوية التي طورتها هذه العزلة في النظام الدينامي كثافات خلايا كبيرة تقابل 8,74 لوغاريتم CFU لكل سنتيمتر مربع في وسط الاستزراع TSB و7,86 لوغاريتم CFU سنتيمتر مربع في الحليب الخالي من الدسم المعقم. أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها مع عزل B.vesicularis أن الزيادة في تركيز المغذيات من 100 إلى 900 ملليغرام لكل لتر أدت إلى زيادة في عدد البكتيريا من الأغشية الحيوية من 6.11 إلى 8.71 سنتيمتر مربع CFU. كما لوحظ نمو كبير في الأغشية الحيوية عندما انخفض معدل التدفق إلى 6.0 ملليلتر في الدقيقة، مما يشير إلى أن بعض العوامل يمكن أن تؤثر على تكوين الأغشية الحيوية في المفاعل الحيوي.
لم يحتوي أي من الأغشية الحيوية على خلايا قابلة للاكتشاف قابلة للاكتشاف في وقت اتصال مدته خمس دقائق في 500 جزء في المليون مع أحماض بيروكسي عضوية و 100،000 جزء في المليون مع تركيزات بيروكسيد الهيدروجين من المطهرات التي تستخدم عادة في مصانع الألبان. أظهر SCM الهيكل ثلاثي الأبعاد للحد الأدنى من تركيز استئصال الأغشية الحيوية غير المعالجة أو الأغشية الحيوية MBEC ، بينما فقدت الأغشية الحيوية MBEC المعالجة شكلها ثلاثي الأبعاد. من الضروري البقاء تحت حالة معقمة أثناء تنفيذ هذا البروتوكول.
أيضا ، يجب أن يتذكر المستخدم أن النتيجة التي تم إنشاؤها مرتبطة بعزل ومطهر فريد. يمكن تقييم الجمع بين المطهر والاهتزاز الميكانيكي أو الموجات فوق الصوتية أو العلاجات الأنزيمية لتحسين فعالية استئصال الأغشية الحيوية. مهد هذا النهج باستخدام طرق ثابتة وديناميكية لتشكيل الأغشية الحيوية الطريق للباحثين لفحص ودراسة تركيبة جديدة مضادة للأغشية الحيوية للتحكم بشكل أفضل في الأغشية الحيوية في مختلف القطاعات.
