الهدف من هذا الإجراء هو مقارنة جهاز الأغشية الحيوية القياسي لغطاء الوتد بجهاز الأغشية الحيوية لبئر البولي بروبيلين العميق من خلال تلطيخ البنفسج البلوري واختبار القابلية لمضادات الميكروبات. يحتوي جهاز البيوفيلم القياسي لغطاء الوتد على 96 أوتادا ويتناسب مع لوحة ميكروتيتر قياسية بقياس 96 بئرا مما يسمح بإجراء تجارب بيوفيلم عالية الإنتاجية. يوفر غطاء الوتد سطحا لنمو الأغشية الحيوية ويمكن تحليل الأغشية الحيوية المزروعة على الأوتاد بشكل أكبر في تجارب المصب.
ومع ذلك ، تستخدم الألواح حجما أقصى يبلغ 200 ميكرولتر مما يجعل من الصعب دراسة تكوين الأغشية الحيوية والكتلة الحيوية باستخدام التجارب التي تتطلب كميات أكبر من الأغشية الحيوية. هنا ، نصف جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة لزراعة الأغشية الحيوية الثابتة. يستخدم جهاز الأغشية الحيوية للآبار العميقة صفيحة ميكروتيتر بئر عميقة بطول 96 بئرا مزودة بلوحة PCR شبه مسننة ب 96 بئرا كغطاء ربط.
تسمح هذه الطريقة بحد أقصى لحجم اللوحة يبلغ 750 ميكرولتر ، وتوفر مساحة سطح ربط أكبر لنمو الأغشية الحيوية ، وهي أقل تكلفة مقارنة بجهاز البيوفيلم القياسي. سنقوم بوصف ومقارنة بروتوكولات تلطيخ البنفسج البلوري للأغشية الحيوية لتحديد الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية ، وكذلك تحديد الحد الأدنى لتركيز استئصال الأغشية الحيوية ، المعروف أيضا باسم MBEC. يظهر نظرة عامة تخطيطية للتجربة التي سيتم وصفها.
قم بربط السلالات البكتيرية المطلوبة من مخزون محفوظ بالتجميد مباشرة على طبق أجار مغذي. احتضان ألواح الأجار بين عشية وضحاها مع ظروف الإجهاد المثلى. في اليوم التالي ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة في خمسة ملليلتر من وسائط النمو وتنمو الثقافات في حاضنة بين عشية وضحاها.
سيتم ملء لوحات البيوفيلم كما هو موضح. املأ الآبار الخارجية ب 750 ميكرولتر من الماء المعقم وآبار التحكم السلبية ب 750 ميكرولتر من وسائط النمو المعقمة. املأ الآبار المتبقية ب 675 ميكرولتر من وسائط النمو المعقمة.
توحيد الثقافات بين عشية وضحاها إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 1.0. قم بإنشاء سلسلة تخفيف عشرة أضعاف حتى يتم الوصول إلى تخفيف 10 إلى ناقص ثلاثة. قم بتلقيح آبار الوسائط باستخدام 10 إلى ناقص ثلاثة مخففات للترعة لتخفيف البكتيريا النهائي من 10 إلى ناقص أربعة والحجم الإجمالي النهائي في البئر من 750 ميكرولتر.
أدخل بعناية غطاء الوتد في لوحة البيوفيلم. احتضان الألواح في ظروف الإجهاد المثلى مع أقصى اهتزاز يبلغ 160 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. قم بإزالة غطاء الربط بعناية من لوحة نمو الأغشية الحيوية وشطف الأغشية الحيوية في صفيحة بئر عميقة جديدة مليئة ب 800 ميكرولتر من PBS المعقمة لكل بئر.
انقل أغطية الوتد إلى صفيحة بئر عميقة جديدة تحتوي على 800 ميكرولتر لكل بئر بوزن 0.1٪ بحجم بنفسجي بلوري والسماح لها بالبقع لمدة خمس دقائق. شطف الأغطية مرة أخرى في طبق بئر عميق طازج مملوء ب PBS لإزالة البقع الزائدة. بعد السماح للأغطية بالجفاف لمدة 10 دقائق في خزانة السلامة البيولوجية ، قم بإزالة الأوتاد في صفيحة بئر عميقة مليئة ب 800 ميكرولتر من حمض الزهد بنسبة 30٪ لكل بئر لمدة خمس دقائق.
أزيلي غطاء الوتد واخلطي جيدا لتوزيع البقعة بالتساوي. انقل 200 ميكرولتر من جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة إلى صفيحة ميكروتيتر قياسية بسعة 96 بئرا واقرأ الكثافة البصرية عند 550 نانومتر. سيتم إعداد لوحات التحدي المضادة للميكروبات كما هو موضح.
املأ الآبار الخارجية ب 750 ميكرولتر من الماء المعقم وآبار التحكم الإيجابية والسلبية ب 750 ميكرولتر من وسائط النمو. املأ الآبار المتبقية ب 750 ميكرولتر من سلسلة التخفيف المضادة للميكروبات المطلوبة. قم بإزالة غطاء الوتد بعناية من الجهاز وشطفه في صفيحة بئر عميقة معقمة مع 800 ميكرولتر لكل بئر من PBS.
انقل غطاء الوتد إلى لوحة التحدي المضادة للميكروبات واحتضنه للإطار الزمني المطلوب للتعرض. قم بإزالة أغطية الربط بشكل معقم من لوحة التعرض لمضادات الميكروبات وشطفها في صفيحة معقمة عميقة مملوءة ب PBS. قم بإزالة غطاء الربط من PBS ونقله إلى لوحة بئر عميقة جديدة تحتوي على 750 ميكرولتر من وسائط الاسترداد لكل بئر.
سونيك الطبق في حمام مائي صوتي لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة غطاء الوتد واستبدله بغطاء لوحة ميكروتيتر مسطح قياسي غير مربوط لتجنب التلوث. احتضان في ظروف الإجهاد الأمثل بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي ، انقل 200 ميكرولتر من صفيحة البئر العميقة إلى لوحة microtiter القياسية واقرأ الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. تلطيخ البنفسج البلوري هو طريقة فعالة وتستخدم على نطاق واسع لتقريب الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية البكتيرية. أظهر تلطيخ الكريستال البنفسجي لأجهزة الآبار القياسية والعميقة أن كلا النوعين البكتيريين نما كتلة حيوية أكبر بكثير على جهاز البئر العميق مقارنة بالجهاز القياسي مع الإشريكية القولونية التي تشكل كتلة حيوية أكثر بمقدار 2.1 ضعف مقارنة بجهاز الأغشية الحيوية القياسي و Pseudomonas aeruginosa التي تشكل 4.1 أضعاف الكتلة الحيوية.
كانت هذه النتائج متسقة مع فرضيتنا القائلة بأن زيادة مساحة سطح جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة من شأنها أن تسمح بزيادة تراكم الكتلة الحيوية. على الرغم من التباين الأكبر في القيم التقنية الملطخة بالسيرة الذاتية لكلا السلالتين اللتين تنموان على جهاز البئر العميق ، لم يلاحظ وجود اختلافات ذات دلالة إحصائية لأي من النوعين باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه أو اختبار T للطالب مع قيم P أكبر من 0.05. تظهر هذه النتيجة أن تكوين الأغشية الحيوية بواسطة أجهزة الآبار العميقة تشكل أغشية حيوية قابلة للتكرار مماثلة لتلك الموجودة في الأجهزة القياسية.
أشارت نتائجنا بعد توحيد الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية للحجم ومساحة سطح الربط بين أجهزة الآبار القياسية والعميقة إلى تفضيل طفيف ولكن كبير للمواد بين النوعين البكتيريين اللذين تم اختبارهما. على جهاز بئر البولي بروبيلين العميق ، أظهر Pseudomonas aeruginosa زيادة نسبية بمقدار 1.4 ضعف في تكوين الكتلة الحيوية وأظهرت الإشريكية القولونية انخفاضا نسبيا بمقدار 1.52 ضعف في تكوين الكتلة الحيوية مع التأثير العكسي الذي لوحظ على الجهاز القياسي للبوليسترين. يشير هذا الاختلاف في تفضيل الأنواع البكتيرية لمواد ربط جهاز البيوفيلم إلى أنه لا يمكن مقارنة النتائج بين أجهزة البيوفيلم.
تم اختبار التحدي المضاد للميكروبات المتمثل في الأغشية الحيوية على مدار 24 ساعة باستخدام مركب الأمونيوم الرباعي كلوريد البنزالكونيوم المعروف بأنه مثبط فعال لتشكيل الأغشية الحيوية البكتيرية ، ولكنه مضاد ميكروبي أقل فعالية للقضاء على الأغشية الحيوية. أظهرت نتائجنا أن قيم BZK BMEC التي تم الحصول عليها من جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة زادت بمعدل ستة أضعاف للإشريكية القولونية وثمانية أضعاف ل Pseudomonas aeruginosa عند مقارنتها بالنمو على جهاز البيوفيلم القياسي. كانت نتائج BZK MBEC أكثر تباينا كما هو متوقع لأنه مضاد ميكروبي أقل فعالية للقضاء على الأغشية الحيوية وأدى إلى مجموعة من قيم الإشريكية القولونية MBEC على كلا الجهازين بسبب اثنين من أوتاد الأغشية الحيوية الشاذة التي نجت بتركيزات أعلى.
قارنا أيضا المبيض المطهر ، المعروف بأنه مضاد ميكروبي فعال للغاية للقضاء على الأغشية الحيوية البكتيرية. أظهر التبييض قيمة MBEC أعلى قليلا عند اختباره في الجهاز القياسي مقارنة بجهاز البئر العميق لكلا النوعين ، مما أدى إلى زيادة أربعة أضعاف في الإشريكية القولونية وزيادة مضاعفة في Pseudomonas aeruginosa على التوالي. ومع ذلك ، كانت هذه الاختلافات ضمن نطاق الخطأ القابل للتكرار بين الأجهزة وأظهرت تباينا أقل بكثير من BZK ، مما يؤكد أن التبييض هو مضاد ميكروبي أكثر فعالية للقضاء على الأغشية الحيوية.
سيكون أحد القيود الرئيسية لكل جهاز من أجهزة الأغشية الحيوية هو التركيب البلاستيكي المختلف للأوتاد والتباين الناتج في الالتصاق وتكوين الكتلة الحيوية لأنواع بكتيرية مختلفة على هذه الأسطح. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مراعاة التفاعلات الكيميائية والتوافق بين مضادات الميكروبات المختلفة ومادة الربط البلاستيكية قبل تنفيذ البروتوكول الموصوف. في الختام ، يظهر هذا البروتوكول والنتائج المستخلصة من مقارنات الكتلة الحيوية لدينا على البئر العميقة وأجهزة الأغشية الحيوية القياسية أن كلاهما قادر على زراعة الأغشية الحيوية القوية للإشريكية القولونية والزائفة الزنجارية باستخدام جهاز البئر العميق الذي يوفر كتلة حيوية أكبر بكثير لكل مساحة سطح ربط من الجهاز القياسي.
يوفر جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة بديلا قابلا للتطبيق وبأسعار معقولة لزراعة الأغشية الحيوية الثابتة وعالية الإنتاجية ودراسات الفحص التي تتطلب كميات أكبر من البيوفيلم للتحليل النهائي. نظرا للاختلافات في تركيبات المواد البلاستيكية بين كل جهاز ، لا يمكن مقارنة الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية الملطخة بالسيرة الذاتية وقيم MBEC مباشرة بين الأجهزة. ومع ذلك ، إذا أجريت التجارب باستمرار على نفس الجهاز ، فإن النتائج التي تم الحصول عليها بين العزلات ومضادات الميكروبات قابلة للمقارنة.
يوصى باستخدام جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة للمختبرات التي ترغب في دراسة الأغشية الحيوية في فحوصات عالية الإنتاجية باستخدام مواد منخفضة التكلفة.
