يعمل نموذجنا المختبري لعضلة القلب البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية ثلاثية الأبعاد على تحسين الإخلاص الحيوي لثقافة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد مع القضاء على الاختلافات بين الأنواع المرتبطة بالتجارب المعملية على. يعمل تصميم المفاعل الحيوي متعدد الأنسجة الخاص بنا مع أجهزة تتبع ما بعد مستقرة على زيادة نجاح الأنسجة إلى أقصى حد ويحسن دقة التوصيف المتعمق لوظيفة أنسجة القلب الهندسية. نظرا لأن قصور القلب لا يزال السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم ، فإن أنسجة القلب المهندسة لدينا تمكن الباحثين من نمذجة أمراض القلب البشرية ، بالإضافة إلى فحص العلاجات المحتملة.
للبدء ، ضع أربعة قوالب رئيسية سالبة من الألومنيوم في حامل الصب بحيث تتماشى فتحات العمود مع المساحة الميتة المقابلة لأرفف المثلث. ضع الجهاز بين قوسين متوازيين وقم بتثبيت الجوانب معا باستخدام قطعة مستطيلة من صفائح السيليكون بسمك 0.5 مم كحشية لمنع تسرب PDMS السائل. في وعاء ضحل ، امزج 0.5 ملليلتر من عامل المعالجة PDMS مع خمسة ملليلتر من قاعدة المطاط الصناعي PDMS بنسبة واحد إلى 10 وحركه بقوة لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة غاز خليط PDMS في غرفة مفرغة تحت فراغ قوي حتى تختفي الفقاعات. بعد ذلك ، صب خليط PDMS على جهاز الصب ، وامتلأ أكثر من اللازم لضمان التغطية الكاملة لكل فتحة. أضف حبات زجاجية ملونة صغيرة إلى جسم رفوف PDMS المقابلة للجانب مع الأعمدة لتحديد فريد لكل رف.
ضع جهاز الصب مستويا أفقيا في غرفة التفريغ تحت فراغ قوي لمدة 12 ساعة على الأقل. اترك PDMS يعالج في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الغبار لمدة 48 ساعة لتمكين المعالجة الكاملة وأقصى قوة للأعمدة الحساسة. قم بإزالة المشبك والأقواس وألواح السيليكون من جهاز الصب.
باستخدام شفرة حلاقة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بقص فيلم PDMS الموجود أعلى جهاز الصب ودعامات الإطار. استخدم الأصابع لفصل رفوف PDMS عن جوانب حامل الجبيرة. أدخل شفرة حلاقة من الفولاذ المقاوم للصدأ في المساحة الميتة بين الجبيرة وحامل الجبس وقم بفصلهما عن بعضهما البعض ، مما يضمن بقاء PDMS الذي يملأ المساحة الميتة مع حامل الجبيرة.
ثم ، باستخدام شفرة حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بقطع أفلام PDMS المتبقية والمساحة الميتة PDMS من أطراف المنشورات. باستخدام الأصابع ، افصل حامل PDMS ببطء عن المدلى بها على الجانب المقابل للوظائف. استمر في تبديل الجوانب حتى تصبح المشاركات خالية من القوالب الرئيسية.
حرر جميع رفوف PDMS والأعمدة كما هو موضح سابقا ، واستخدم شفرة حلاقة حادة لتقليم أي PDMS زائد متبقي من الرفوف. باستخدام طابعة 3D تنصهر ترسيب تنصهر بالحرارة ، طباعة مكونات تعقب آخر مستقر ، أو SPoT ، جهاز الصب. تأكد من ملاءمة الصحافة الآمنة بين القطع المطبوعة 3D وبين رفوف PDMS والرقصة ثلاثية المحاور.
تأكد أيضا من أن رفوف PDMS تتناسب بشكل مريح مع الأعمدة التي تصل للتو إلى قاع الآبار دون ثنيها. امزج 0.5 ملليلتر من PDMS الأسود الجزء أ إلى 0.5 ملليلتر من الجزء ب في قارب وزن صغير ، أو حاوية ضحلة حتى يصبح المحلول موحد اللون. قم بإزالة غاز PDMS الأسود المختلط في غرفة مفرغة تحت فراغ قوي لمدة 20 دقيقة.
صب PDMS الأسود الذي تم تفريغه على القاعدة المطبوعة 3D لملء الثقوب والنقر لضمان عدم بقاء فقاعات. كشط أكبر قدر ممكن من PDMS الزائدة من القاعدة. قم بتثبيت القطعة ثلاثية المحاور على القاعدة وضع رفوف PDMS في الأخاديد على الرقصة ثلاثية المحاور ، مما يضمن أن نهايات الأعمدة تغمس في PDMS الأسود في الآبار الدائرية.
اترك PDMS الأسود يعالج في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الغبار لمدة 48 ساعة. حرك القطعة ثلاثية المحاور للخارج ، مما يقلل من التوتر على الأعمدة. باستخدام ملقط صغير ، اكشط فيلم PDMS الأسود الرقيق المحيط بكل SPoT ، ثم أدخل ملقط منحني ذو رؤوس دقيقة في بئر SPoT لتحريره من القاعدة المطبوعة 3D.
افحص SPoTs وقم بقص أي فيلم PDMS أسود متبقي من عملية الصب باستخدام مقص فانا ناعم. تأكد من أن المشاركات النهائية بالطول الصحيح عن طريق تركيب رفوف PDMS على إطار الهاتف الخلوي polys ، ثم حركها على لوحة القاعدة السوداء. بعد تعقيم المفاعل الحيوي وإعداد خليط الخلية ، تابع تصنيع hECTs.
مرتديا قفازات معقمة ، قم بإزالة لوحة القاعدة السوداء من كيس التعقيم الذي يحتوي على أجزاء المفاعل الحيوي وضعه في طبق سعة 60 ملليلتر مع توجيه الآبار لأعلى. ماصة 44 ميكرولتر من خليط الخلية في كل بئر ببطء لتجنب إدخال الفقاعات. ارتداء زوج جديد من القفازات المعقمة ، قم بإزالة إطار البولي سلفون مع رفوف PDMS من كيس الأوتوكلاف.
قم بخفض الإطار على لوحة القاعدة بحيث تتناسب نهايات الإطار مع الأخاديد الموجودة في نهاية لوحة القاعدة. تأكد من أن جميع الأعمدة مستقيمة وأن الإطار غير مائل ، ضع المفاعل الحيوي في طبق 60 ملم. أضف ملليلتر واحد من 10٪ FBS في وسط صيانة خلايا عضلة القلب إلى طبق 60 ملليلتر لزيادة الرطوبة مع تصلب hECTs.
ضع الطبق بدون غطاء في طبق رفيع المستوى بحجم 100 ملم وقم بتغطيته بغطاء طبق 100 ملم ، ثم أعد المفاعل الحيوي إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية ، 5٪ للسماح للكولاجين بتكوين هلام مع الخلايا المعلقة. بعد ساعتين ، أخرج الطبق من الحاضنة. أضف 13 ملليلتر من 10٪ FBS في وسط صيانة خلايا عضلة القلب ، وقم بإمالة الطبق للسماح للوسيط بالتدفق بين لوحة قاعدة PTFE ورفوف PDMS.
افحص المفاعل الحيوي من الجانب لعدم وجود فقاعات هواء وأعد الطبق إلى الحاضنة. إذا كان الهواء محاصرا ، فقم بإمالة المفاعل الحيوي خارج الوسط للسماح للفقاعة بالكسر وخفضها ببطء مرة أخرى ، أو استخدم ماصة صغيرة مع طرف تحميل هلام لسحب الهواء دون إزعاج الأعمدة. افحص ضغط hECT من خلال النافذة في الإطار.
على مدار 24 إلى 96 ساعة ، يتم ضغط hECTs وتصبح معتمة. قم بإزالة لوحة القاعدة عندما يتم ضغط hECTs بنسبة 30٪ على الأقل مقارنة بالقطر الأصلي. املأ الطبق الذي يبلغ طوله 60 ملم والذي يحتوي على المفاعل الحيوي بوسط صيانة خلايا عضلة القلب حتى يتدفق السائل بشفة الطبق وأضف 14 ملليلترا إلى طبق جديد بحجم 60 ملم.
أثناء ارتداء قفازات معقمة ، اقلب المفاعل الحيوي في طبقه بحيث تكون لوحة القاعدة في الأعلى. بعد فحص فقاعات الهواء المحبوسة ، ارفع لوحة القاعدة ببطء ، مع الحفاظ على مستويها. تأكد من التركيز على نصائح المنشور.
قم بتشغيل مفتاح العتبة واضبط شريط التمرير حتى يتم ترسيم SPoTs بشكل جيد ولا تغير الشكل عند تعاقد hECT. استخدم أداة المستطيل لرسم مستطيل حول أحد SPoTs ، وانقر فوق الزر "تعيين واحد" داخل مربع حدود المنشور لتعيين موضع المستطيل حول SPoT ، مما يضمن بقاء SPoT دائما داخل حدود المستطيل. كرر العملية إلى المنشور الآخر وقم بتسجيلها ضمن المجموعة الثانية.
اضبط إعدادات حجم الكائن لمنع البرنامج من تتبع الكائنات الأصغر ، وتأكد من أن عدد الكائنات التي يتم تتبعها في كل مستطيل يظل ثابتا. تعرض الواجهة المسافة المقاسة بين الكائنات المتعقبة في الوقت الفعلي. استخدم هذا الرسم البياني لمراقبة الضوضاء.
تحت رأس هرتز تردد السرعة ، أشر إلى نطاق الترددات المطلوبة والفاصل الزمني المطلوب للانتقال من دقيقة إلى قصوى. في المربعات الموجودة على اليمين ، اختر وقت الإعداد المطلوب للسماح ل hECT بالتكيف مع تردد السرعة الجديد ، ثم حدد وقت التسجيل وجهد السرعة. ابدأ البرنامج بالنقر فوق زر بدء البرنامج.
بعد تسجيل البيانات من تردد واحد ، قم بزيادة تردد المحفز بالفاصل الزمني المطلوب لتسجيل جديد حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى للتردد. يتم عرض الصور التمثيلية ل hECTs هنا كما يتم عرضها من الأسفل ، والتي تم إنشاؤها بدون SPoTs ومع SPoT. قدمت SPoTs شكلا واحدا محددا لتتبعه أثناء الحصول على البيانات.
في بعض الحالات القصوى ، تم حجب كائن التتبع. شكل أكثر موثوقية للتتبع البصري والحد من الضوضاء مكن من قياس الأنسجة الضعيفة بقوة متطورة منخفضة تصل إلى نيوتن واحد ميكرو. قدمت SPoTs هندسة غطاء منعت خسارة hECT.
كانت دالة hECT المقاسة مستقرة خلال وقت الاستزراع الممتد في إعداد السرعة الحالي مع المرحلة الساخنة. مقارنة بالقياسات في درجة الحرارة الفسيولوجية ، أظهرت hECTs ديناميكيات انكماش متغيرة في درجة حرارة الغرفة ، مع معدلات أبطأ من الانكماش والاسترخاء. عند الترددات الأعلى ، تميل hECTs إلى أن تكون أضعف في درجة حرارة الغرفة.
عند الترددات المنخفضة ، تميل hECTs إلى أن تكون أقوى في درجة حرارة الغرفة. عندما تسير بسرعة 36 درجة مئوية ، كان لدى hECTs معدل ضربات عفوي أعلى ونطاق أكثر اتساعا من ترددات الالتقاط. تضمن البيئة التي يتم التحكم في درجة حرارتها الأهمية الفسيولوجية لوظيفة hECTs المقاسة.
بالإضافة إلى ذلك ، يسهل حمام الوسائط المشترك للمفاعل الحيوي متعدد الأنسجة دراسات إشارات paracrine بين hECTs من تركيبات خلوية مختلفة. تسمح إضافة SPoTs إلى مفاعلنا الحيوي متعدد الأنسجة للباحثين بدراسة عضلة القلب المريضة بكفاءة مع توتر مرتفع أو منخفض بشكل غير طبيعي ، والذي قد ينزلق من نهايات الوظائف غير المغطاة.
