هنا ، استخدمنا FRET أحادي الجزيء ، ووضع علامات البروتين الخاصة بالموقع عبر دمج الأحماض الأمينية الطبيعية لدراسة الديناميكيات التوافقية ل mGluR2. هذا يسمح بدراسة ديناميكيات البروتين دون إزعاج بنية البروتين. يوفر الهيكل الذري صورة ثابتة للبروتين.
ومع ذلك ، فإن FRET أحادي الجزيء يمكننا من تصور مجموعة كاملة من حركة البروتين في الوقت الفعلي والمحلول. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة ديناميكيات أي بروتين. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام دمج الأحماض الأمينية الطبيعية لدراسة التفاعلات بين البروتين والبروتين ، وهندسة المستقبلات الاصطناعية.
يتطلب تحميل العينات وتحسين التصوير الصبر والممارسة. للبدء ، ضع علامة على الثقوب المراد حفرها على الشريحة الزجاجية باستخدام علامة. استخدم Dremel لحفر ثقوب صغيرة على الشريحة أثناء غمس الشريحة في الماء.
قم بإلغاء صوت الشرائح وتغطية الانزلاقات في الأسيتون لمدة 30 دقيقة في سونيكتور الحمام عند 23 درجة مئوية. تخلص من الأسيتون من الشريحة وقم بتغطية الجرار المنزلقة. شطف جيدا بالماء ، وسونيكات في هيدروكسيد البوتاسيوم خمسة مولار لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، شطف الشرائح وتغطية الانزلاق بالماء ، وسونيكات في الميثانول لمدة دقيقتين. اترك الجرار مملوءة بالميثانول حتى خطوة التملح الأميني. صب خليط التملح الأميني الطازج في الشريحة وقم بتغطية الجرار المنزلقة.
احتضان ، سونيكات ، ومرة أخرى احتضان الشرائح وتغطية الانزلاقات في خليط الملوحة الأمينية قبل التخلص من المحلول. بعد ذلك ، اغسل الجرار بالميثانول قبل ملئها بالماء. ثم شطف الشرائح بالماء.
جففها بضربة هوائية ، وضعها في صناديق التجميع. ضع 60 ملليلتر من محلول PEGylation على الشريحة ، وضع شريحة غطاء فوقها. ضع علامة على الجانب غير PEGylated قبل التخزين.
بعد الحضانة ، قم بتفكيكها بلطف وشطف الشرائح وتغطية الشرائح بالماء. ثم قم بتجفيفها عن طريق نفخ الهواء ، وضعها في أنبوب معقم سعة 50 ملليلتر مع واجهة سطح PEGylated بعيدا عن بعضها البعض. بعد تمرير خلايا HEK 293T مع 0.05٪ من التربسين-EDTA ، قم بزرع الخلايا على انزلاقات غطاء poly-L / D-lysine.
ضع الوسائط القياسية مع الوسائط المكملة AZP للخلايا النامية ومستقبلات الغلوتامات الأيضية 2 ، أو تعبير mGluR2. ثم قم بنقل الخلايا باستخدام كاشف نقل ، واحتضنها لمدة 24 ساعة قبل تغيير الوسط باستخدام وسائط مكملة AZP جديدة. قبل 20 دقيقة من وضع العلامات باستخدام أصباغ السيانين الألكينية، اغسل الغطاء مرتين باستخدام مخزن التسجيل البخاخ الدافئ أو RB، وضعه في وسائط قياسية دافئة بدون AZP.
ثم قم بإزالة الوسائط القياسية واغسل الخلايا باستخدام RB قبل إضافة محلول وضع العلامات الطازج. احتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية في الظلام. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول وضع العلامات.
اغسل زلة الغطاء التي تحتوي على خلايا منقولة مرتين باستخدام RB ، وأعد تعليقها في نفس الوسط. بعد ذلك ، قم بتكوير الخلايا عن طريق الدوران عند 1000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة supernatant قبل إعادة تعليق الكريات في 80 إلى 130 ميكرولتر من محلول التحلل. كسر الكريات عن طريق السحب.
ثم لفها في رقائق معدنية ، وضعها على الروك عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة لتحليل الخلايا. حبيبات الكسر غير القابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 20،000 غرام وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم انقل السوبرنات إلى أنبوب بارد طازج ، وقم بتخزينه على الجليد.
قم بإزالة الشريحة وغطاء الانزلاق من الفريزر ، واتركها تدفأ في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قم بتجميع الغرفة عن طريق وضع شرائح الشريط على الوجهين بين الانزلاق والغطاء ، مما يضمن أن الأسطح PEGylated تشكل الجزء الداخلي من غرفة التدفق. باستخدام طرف ماصة، اضغط على شريحة الغطاء للتأكد من أن الشريط يلامس الغطاء الانزلاق وينزلق.
ضع الإيبوكسي على حواف الشريحة. ضع 40 ميكرولتر من نيوترافيدين 500 نانومولار على كل حارة ، واحتضنها داخل صندوق مظلم رطب. بعد دقيقتين ، اغسل كل ممر غرفة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت T50.
ثم أضف 20 محلول أجسام مضادة بيوتينيل نانومولار ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة قبل الغسيل باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت T50 لكل حارة. قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر. ثم قم بتشغيل الليزر للإحماء.
بعد ذلك ، قم بتشغيل كاميرا EMCCD ، وافتح البرنامج. قم بتركيب غرفة العينة على مرحلة المجهر ، وأضف عينة البروتين تدريجيا لتحقيق ما يقرب من 400 جزيء لكل مجال رؤية. اغسل الغرفة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير المكمل ب 0.3 وحدة من البروتوكاتيشوات 3 ، 4-ثنائي الأكسجين.
اضبط الكسب ومعدل الاكتساب وقوى الليزر للكشف عن إشارات التألق أحادية الجزيء في كل من قنوات المتبرع والمتقبل. ثم إثارة المتبرع ، والحصول على آثار الوقت حتى يتم تبييض 80 ٪ من جزيئات المتبرع في مجال الرؤية ضوئيا. في نهاية الفيلم ، قم بتشغيل ليزر 640 نانومتر لإثارة المتقبل مباشرة حتى يتم تبييض بعض الجزيئات ضوئيا.
تغيير مجال الرؤية، وتكرار الخطوات لإثارة المتبرع والمتقبل لجمع ثلاثة أفلام لكل حالة. لاختيار آثار FRET أحادية الجزيء لقطف الجسيمات ، حدد الآثار التي تكون فيها الكثافة الإجمالية لآثار المتبرع والمتقبل مستقرة بمرور الوقت. ثم حدد الآثار مع التغيرات المضادة للارتباط في كثافة المتبرع والمتقبل.
حدد جزيئات المتبرع والمتقبل التي تظهر التبييض الضوئي أحادي الخطوة وتتبع أكثر من خمس ثوان. حساب نقص FRET. وأخيرا، حدد الحالة التوافقية بواسطة نمذجة ماركوف المخفية، أو HMM، باتباع الخطوات الموضحة في المخطوطة.
تم تحقيق وضع العلامات على AZP بواسطة أصباغ السيانين من خلال تفاعل الإضافة الحلقية المحفزة بالنحاس ، وأدى إلى وضع علامات فعالة على غشاء البلازما 548UAA مع وضع علامة على مجموعة سطح الخلية مع الفلوروفورات المانحة والمتقبلة. في الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، لوحظ نطاق واحد عند 250 كيلو دولار في خلايا HEK 293T التي تعبر عن 548UAA ، والتي تزامنت مع mGluR2 dimeric كامل الطول. يتم عرض آثار انتقائية تمثيلية للعديد من أحداث التبييض قصيرة الأجل وطويلة الأجل للمتبرعين والمتقبلين هنا.
تم تحديد الحالات التوافقية باستخدام تحليل HMM. تم استخراج الانتقالات بين حالات FRET المنفصلة من الملاءمة المثالية ، وتم رسمها كخريطة حرارية لكثافة الانتقال. كما تسفر آثار FRET المثالية عن معلومات حول وقت الإقامة لكل تأكيد محدد.
تظهر آثار الجزيء الواحد مع قناة المتبرع والمتقبل هنا. علاوة على ذلك ، يكشف الجزيء الواحد FRET عن أربع حالات توافقية للمجال الغني بالسيستين mGluR2. يعد الحفاظ على الذروة الفعالة أمرا ضروريا لسحب الجزيء الواحد لأسفل ، ويجب توخي الحذر أثناء هذه العملية.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب إضافة عامل كسح الأكسجين مباشرة قبل التصوير. تم تطبيق طريقة وضع العلامات هذه وتجارب FRET أحادية الجزيء على مستقبلات متعددة ، وقدمت رؤى جديدة حول آلية تنشيط المستقبلات وتعديل وظيفة المستقبلات.
