كانت المعلومات الهيكلية حول كيفية إزالة إنزيمات إصلاح استئصال القاعدة لآفات الحمض النووي في سياق الكروماتين نادرة. وهذا يشكل فجوة كبيرة في فهمنا للآليات التي ينطوي عليها مسببات الأمراض البشرية. الميزة الرئيسية لبروتوكولنا هي أننا قمنا بتحسين إعداد العينات باستخدام معدات المختبرات القياسية.
سيسمح ذلك لعلماء الكيمياء الحيوية الآخرين في هذا المجال باستكمال عملهم الكيميائي الحيوي بدراسات cryo-EM الممكنة تقنيا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام بروتوكولنا لدراسة كيفية إشراك العوامل الأخرى، بما في ذلك عوامل النسخ الرائدة، في النيوكليوسوم. هذا مجال كانت فيه المعلومات الهيكلية محدودة أيضا.
كان تحسين تحضير العينة قبل الانتقال إلى ظروف التجميد أمرا أساسيا لدفع مشروعنا إلى الأمام ، ومن الأفضل القيام بذلك باستخدام المقايسات البيوكيميائية القياسية في تصميم الركيزة والربط وظروف الربط المتقاطع. للبدء ، احتضان NCP وعامل إصلاح الحمض النووي محل الاهتمام على الجليد لمدة 15 دقيقة باستخدام مخزن مؤقت مثالي للمجمع المحدد. ثم ، أضف الجلوتارالدهيد إلى تركيز نهائي قدره 0.005٪بعد خلطه جيدا ، احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 13 دقيقة.
إخماد مع ضرس واحد Tris-CL إلى تركيز نهائي من 20 مليمولار Tris-CL مع الرقم الهيدروجيني 7.5. بعد ذلك ، ركز على حوالي 50 ميكرولترا واستبدل المخزن المؤقت بمخزن مؤقت متجمد باستخدام عمود تحلية. بعد ذلك ، حدد الامتصاص عند الكثافة البصرية 280 و 260 نانومتر وركز أكثر إذا لزم الأمر للوصول إلى 1.3 إلى 3 ملليغرام لكل ملليلتر بناء على الكثافة البصرية 280 نانومتر.
بعد تحضير زر غسيل الكلى، ضع الزر الذي يحتوي على العينة أعلى طبقة من البولي إيثيلين جلايكول مع توجيه الغشاء لأسفل. لإجراء التنقية حسب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، اغسل ووازن عمود استبعاد الحجم ب 60 ملليلتر من الماء المقطر ، متبوعا ب 80 ملليلتر من المخزن المؤقت للتجميد طوال الليل بمعدل 0.4 ملليلتر في الدقيقة. بعد ذلك ، قم على الفور بتحليل كسور الذروة وتركيز تلك الكسور التي تحتوي على بروتين ضخ الهستون MBP-PolBeta-APE1.
ستوضح الإجراءات التالية إليزابيث فيفريت ، متدربة ما بعد البكالوريا من قلب cryo-EM هنا في المعاهد الوطنية للصحة. بعد تشغيل الفريزر المغرق وملء المرطب ب 50 مل من الماء المقطر ، اضبط درجة حرارة الغرفة على 22 درجة مئوية والرطوبة على 98٪ثم ضع كوب الإيثان وكوب النيتروجين السائل في أصحاب المساحة المعنيين. بعد ذلك ، قم بتغطية كوب الإيثان بموزع غطاء الإيثان واسكب النيتروجين السائل فوقه بعناية مع ملء كوب النيتروجين أيضا بالنيتروجين السائل.
عندما يستقر مستوى النيتروجين السائل ويصل إلى 100٪ وتصل درجة الحرارة إلى 180 درجة مئوية تحت الصفر ، افتح صمام الإيثان بعناية واملأ كوب الإيثان حتى يشكل فقاعة على الغطاء الشفاف. ثم قم بإزالة موزع الإيثان. ضع ورقتي ترشيح على جهاز النشاف وثبتهما بحلقة معدنية.
انتقل إلى الإعداد واضبط معلمات النشاف كما هو موضح في المخطوطة ، ثم حدد A-Plunge وانقر فوق موافق. على الشاشة الرئيسية ، انقر فوق Load Mailps وقم بتحميلها بشبكة بحيث يكون جانب تطبيق الكربون متجها نحو اليسار. قم بمعايرة الملقط ، واضبط المحور Z لضمان وجود وصمة عار صلبة. انقر فوق الغرفة السفلية وقم بتطبيق ثلاثة ميكرولتر من المجمع.
ثم انقر فوق Blot A-Plunge ، والذي سيقوم بتدوير الشبكة لمسح من الأمام وسيغرقها وتجميدها. بعد النقل ، قم بتخزين الشبكة في صندوق الشبكة في غرفة النيتروجين السائل. عندما يتم تجميد جميع الشبكات الأربع ووضعها في صندوق الشبكة ، قم بتدوير الغطاء إلى الوضع المحايد حيث يتم تغطية جميع الشبكات بالغطاء وإحكام ربط المسمار.
قبل تحميل العينات في المجهر ، ضع الشبكات المزججة على حلقة وقم بتثبيتها باستخدام مشبك C تحت النيتروجين السائل في غرفة يتم التحكم فيها بالرطوبة لتجنب تلوث الجليد. عند تحميل المجهر ، أدخل الشبكات في شريط كاسيت مكون من 12 فتحة. قم بخلط الكاسيت في كبسولة nanocab وقم بتحميله في أداة التحميل التلقائي.
ثم انقل الشبكة من الكاسيت إلى مرحلة المجهر. اضبط المرحلة على ارتفاع eucentric عن طريق تذبذب المرحلة 10 درجات وتحريك ارتفاع Z في نفس الوقت حتى يتم ملاحظة الحد الأدنى من الإزاحة المستوية في الصور. بمجرد الوصول إلى الارتفاع المركزي ، ابدأ التصوير عن طريق التقاط صورة مونتاج 3 × 3 للشبكة حيث يتم التقاط كل مونتاج بتكبير 62x للحصول على الأطلس.
بعد اختيار ثلاثة مربعات بأحجام مختلفة وأخذ الارتفاع المركزي ، قم بتكبير الصورة بمعدل 210 أضعاف. بمجرد تصوير مربع ، اختر ثقبا واحدا من كل من الحافة والوسط وما بين المربعات. ثم ، قم بتصوير كل ثقب بتكبير 2،600x.
التقط صورة التكبير العالي من مركز الفتحة بتكبير 36 ، 000x ووقت تعريض 7.1 ثانية ، و 60 إطارا ، وحجم 1.18 بكسل ، وإلغاء التركيز البؤري ثلاثة ميكرومتر. انظر الصور التمثيلية للعرض. لتحديد نسبة NCP إلى MBP-PolBeta-APE1 لتشكيل مجمع مستقر ، تم إجراء فحوصات تحول الحركة الكهربية ، والتي أظهرت نطاقا أحادي الإزاحة من NCP مع زيادة مولية بمقدار خمسة أضعاف من MBP-PolBeta-APE1.
في حجم أصغر ، أظهر تجميع مجمع NCP-PolBeta-APE1 أن العينة كانت مترابطة بشكل مفرط وأسفرت عن مجاميع بدون معقدات فردية ملحوظة. ومع ذلك ، أدى التخفيف بمقدار عشرة أضعاف في نقاط الاتصال الوطنية إلى انخفاض كبير في التجميع وتحسين استقرار الجسيمات. يمكن الجمع بين طرق استبعاد الجل التحضيري والحجم حيث يحسن الجل التحضيري جودة NCPs عندما تحتوي على كمية كبيرة من الركام عالي الوزن الجزيئي ، يليه تنقية المركب عن طريق استبعاد الحجم.
تظهر النتائج أنه يمكن استخدام كلتا الطريقتين بشكل مستقل لتوليد مجمعات مستقرة. علاوة على ذلك ، تظهر البيانات التي تم جمعها من كلتا الشبكتين فئات ثنائية الأبعاد متطابقة تقريبا وخرائط ثلاثية الأبعاد بدقة 3.2 أنجستروم تقريبا. يجب تحديد النسبة المثلى من NCP إلى عامل إصلاح الحمض النووي أولا ، ثم يجب إجراء الربط المتقاطع للمجمع مع الجلوتارالدهيد على الأقل 10 مرات أكثر مخففا من التركيز اللازم للتجميد.
بعد الحصول على خريطة cryo-EM 3D للمجمع ، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين الهيكلي لتحديد كيفية العثور على عامل إصلاح الحمض النووي وتحديد المناطق المهمة لهذه التفاعلات.
