لقد تناولنا أمزجة التنشيط وإعادة حساب الدواء ل S1PRS من قبل الطاقم ، والتلاعب بالأسواق الناشئة وحالة GI INHAB A M P A والأساس الأقل أهمية لتطوير دواء يستهدف بقوة تطورات S1PRS في جعل من الممكن إظهار اللوحات السفلية المزيفة لتحفيز GP ZR أو السكن والمزيد من الفوائد في الكشف عن مواقع الربط الطبيعية لإنشاء الأدوية المستهدفة T BCR. جودة العينة هي الأساس لكل شيء في تجربة EM الصحيحة. العوامل الأساسية للتحضير البسيط تشمل حالة المنتج المختلفة لبيع خط SF وتركيز N g مما يدل على الإجراء سيكون Heli Wang طالب دراسات عليا من مستواي.
لتحميل تنقية البروتين ، فإن مشهد الإصبع هذا واحد من مستقبلات الفوسفات أو S one P R S G محلول مركب للبروتين إلى كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو عمود ترشيح S E C هلام متوازن مسبقا مع المخزن المؤقت S E C بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة عند أربع درجات مئوية. لاستخدام الكسور المجمعة للمجهر الإلكتروني المبرد ، قم بتركيزها باستخدام مكثف قطع 100 كيلودالتون عند 1،300 XG عند أربع درجات مئوية. أثناء معالجة البيانات للتصنيف ثنائي الأبعاد في التصنيف الأولي للجسيمات، اختر وظيفة التصنيف ثنائي الأبعاد في برنامج الاعتماد على وانقر فوق استعراض على يمين ملف نجمة صور الإدخال في خيار IO.
ثم اختر particles.star. بعد ذلك ، في خيار التحسين ، اضبط عدد الفئات على 100 وقطر القناع A على 140. في خيار الحساب، اضبط عدد الجسيمات المجمعة على 10 وأدخل الدليل من محرك أقراص محلي سريع وسريع في حقل نسخ الجسيمات إلى دليل الخدش.
لمعالجة أسرع، حدد نعم لتسريع وحدة معالجة الرسومات المستخدمة. لاختيار مجموعة فرعية من نتائج 2D الجيدة كقوالب ، انتقل إلى خيار IO لوظيفة تحديد المجموعة الفرعية وانقر فوق تصفح إلى يمين فئات التحديد من model.star. بعد ذلك، اختر run_it025_model.
نجمة كإدخال وانقر على تشغيل في النافذة المنبثقة تحقق من فرز الصور على وعكس الفرز. ثم انقر على الشاشة. بعد اختيار نتائج 2D تمثيلية جيدة كمرجع للرجوع إليها في وظيفة الانتقاء التلقائي ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد حفظ الفئات المحددة.
لاستخدام القالب للجولة الثانية من الانتقاء التلقائي، انتقل إلى خيار IO لوظيفة الانتقاء التلقائي. انقر فوق استعراض على يسار الصور المجهرية للإدخال للانتقاء التلقائي، واختر micrographs.star. ثم انقر فوق تصفح على يمين مراجع 2D واختر class_averages.star.
أيضا ، حدد لا ل أو استخدم leplossian في Gaussian. بعد ذلك ، قم بإجراء استخراج الجسيمات باستخدام لاحقة تسطير سفلي الحبل تسطير سفلي تلقائي pick.star. أداء تصنيف 2D باستخدام الجسيمات.
النجمة، متبوعة بتحديد مجموعة فرعية باستخدام تسطير التشغيل تحت الصفر 20 five_optimizer. نجمة لاستخراج الجسيمات، بعد النقر فوق استعراض إلى يسار ملف نجمة المجهر في خيار IO، اختر الصور المجهرية. نجمة وحدد نعم ل أو إعادة استخراج الجسيمات المكررة.
بعد النقر فوق استعراض على يمين ملف نجمة الجسيمات المكررة، حدد الجسيمات. نجمة لإنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد أولي وخريطة مرجعية ، انقر فوق تصفح النموذج الأولي ثلاثي الأبعاد على يمين ملف نجمة صور الإدخال في خيار IO واختر particles.star السابق. ثم في خيار التحسين ، اضبط عدد الفئات على واحد وقطر القناع A على 140.
للتصنيف ثلاثي الأبعاد وإنشاء خريطة أولية ثلاثية الأبعاد ، بعد اختيار الجسيمات. نجمة كما هو موضح سابقا ، انقر فوق تصفح إلى يمين الخريطة المرجعية واختر نموذج تسطير سفلي أولي نقطة mrc. ثم، في خيار التحسين، اضبط عدد الفئات على أربعة إلى ستة وقطر القناع A على 140.
لتوليد القناع ، بعد تحديد خريطة 3D جيدة كإدخال في خيار IO ، قم بتعيين عتبة الربط الأولية إلى 0.05 ، وتوسيع الخريطة الثنائية إلى هذا العدد الكبير من وحدات البكسل إلى ثلاثة. بعد ذلك ، انتقل إلى خيار القناع واضبطه. أضف حافة ناعمة إلى هذا العدد الكبير من وحدات البكسل إلى ثمانية.
للمعالجة التالية ، افتح برنامج Trino Spark ، وقم بإنشاء مساحة عمل جديدة ، وانقر فوق منشئ الوظائف للوظيفة الأولى. لاستيراد مكدس الجسيمات، أدخل مسار الجسيمات في حقل مسار ميتا الجسيمات ومسار الأفلام في حقل مسار بيانات الجسيمات. بعد ذلك ، قم باستيراد وحدات تخزين ثلاثية الأبعاد عن طريق إدخال مسار أفضل وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد تم إنشاؤها من قبل في مسار بيانات وحدة التخزين ، وتحديد قناع لنوع وحدة التخزين التي يتم استيرادها.
للصقل غير المنتظم، اسحب جسيمات التسطير السفلي المستوردة التي تم إنشاؤها مسبقا كمدخلات لجسيمات التكرير غير الموحدة. حجم التسطير المستورد ، تسطير واحد كمدخل حجم التكرير غير الموحد وقناع التسطير المستورد يسطر واحد كمدخل قناع تنقيحات غير موحدة. قناع. بعد ذلك ، انقر فوق Q لبدء المعالجة وكرر الإجراء للحصول على دقة جيدة.
S1PRGI خريطة 3D. بعد بناء البلازميد وإعداده للنقل العابر ، أضف ميكروغرام من الحمض النووي المحضر إلى 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكاشف النقل. اخلطي المزيج عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان وقم بتدوير الخليط لفترة وجيزة قبل الاستخدام.
أضف أربعة ميكرولترات من كاشف النقل واخلطه عن طريق الدوامة والغزل كما هو موضح سابقا. بعد احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، قم بإسقاط 200 ميكرولتر ببطء من مزيج النقل في كل بئر من صفيحة من ستة آبار تحتوي على خلية واحدة CHOK وهز اللوحة بلطف أو خلط شامل. بعد أربع إلى ست ساعات من الحضانة ، استبدل وسط النقل بوسط نمو الخلية المكون من F 12 medium و 10٪ fbs قبل إعادة اللوحة إلى الحاضنة.
24 إلى 48 ساعة بعد حصاد التحويل للخلايا ، قم بتعليق الخلايا في ثلاثة ملليلترات من مخزن SA العازل مع ملح البوتاسيوم D luciferian. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 90 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة بئر 96 مختلطة بلطف واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. لتحديد إشارة التألق ، أولا ، قم بإعداد محاليل مخزون 10 ملليمولار من سيبونيمود في D M S O.ثم قم بإجراء تخفيف تسلسلي في المخزن المؤقت H B S S الذي يحتوي على 25 فورسكالين ميكرومولار وتحفيز الخلايا ب 10 ميكرولترات من تركيزات مختلفة من هذا المحلول الناهض لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بحساب إشارة التلألؤ في قارئ microplate عن طريق تحديد التلألؤ لطريقة الكشف. نقطة النهاية لنوع القراءة، وألياف التلألؤ لنوع البصريات في البرنامج المقترن. أيضا ، اضبط مكاسب البصريات على 255.
ثم قم باستيراد قيم إشارة التألق التي تم الحصول عليها إلى برنامج جدول بيانات ، وقم بمعالجة البيانات باستخدام وظيفة استجابة منحنى الانحدار غير الخطي لتناسب الجرعة. يمكن تنقية مجمع S1PRS GI بنجاح بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، والتي تم التحقق منها بواسطة صفحة SDS. علاوة على ذلك ، كان بروتوكول المجهر الإلكتروني المتبع في هذه الدراسة فعالا في التمييز بين جسيمات S1PRSGI ذات الفئات ثنائية الأبعاد الواضحة والمحددة جيدا والجسيمات ذات الجودة الرديئة.
وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء خريطة مجهرية إلكترونية ل S1PR3 GI بدقة جيدة عن طريق ارتباط الغلاف الفروي من خلال الصقل غير المنتظم. بعد التحليل الهيكلي ، تم إجراء الفحوصات الوظيفية ل S one P R Three عن طريق نقل خلايا C H O K مع بلازميدات المستقبل والمستشعر ، والتي كشفت أن نسبة بلازميد المستقبل إلى بلازميد المستشعر من واحد إلى ثلاثة تنتج نتائج مثالية. ومع ذلك ، كانت النتائج أقل واقعية في خلايا هيك 2 93 في تلك المعالجة ، فإن اختيار الخوارزميات في قسم الجسيمات وقسم التصنيف 2D و 3D مهم لحل مجمعات البروتين MPS G خاصة لنمذجة التسريبات و ecfs.
