تشعيع جاما هو علاج يستخدم على نطاق واسع لسرطان القولون والمستقيم. وعلى الرغم من أنه فعال علاجيا ، إلا أن له آثارا سلبية على الجهاز الهضمي. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة تنشيط الخلايا وتمايزها وهجرتها أثناء التجدد بعد الإصابة الإشعاعية.
يصف هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار للإصابة الإشعاعية. الأهم من ذلك ، يسمح هذا النموذج بتتبع مصير الخلايا المعوية بعد الإصابة ، وبالتالي يوفر فهما أفضل للقدرة التجديدية لمجموعة فرعية معينة من الخلايا. يمكن أن تستخدم هذه التقنية نماذج حيوانية متميزة لتتبع النسب لدراسة السلوك في الوقت الفعلي وتفاعل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة للخلايا بعد الإصابة.
يجب أن تسمح التعديلات الطفيفة على هذا البروتوكول بالتحقيق في العلاقات بين الجراثيم ومجموعات الخلايا الظهارية واللحمية والخلايا المناعية المختلفة عند الإصابة الإشعاعية. للبدء ، أعد تعليق مسحوق تاموكسيفين في زيت الذرة المعقم بتركيز 30 ميكروغرام لكل ميكرولتر. Sonicate لمدة ثلاث دقائق في 30 ثانية دورات تشغيل وإيقاف بسعة 60٪.
تخلط بالتناوب في الظلام لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد EdU عن طريق إضافة DMSO المعقم إلى مسحوق EdU. أضف 1/5 من الحجم الكلي ، وأضف ببطء الحجم المتبقي من الماء المعقم عالي النقاء.
عندما يذوب تماما ، القسمة وتخزينها في 20 درجة مئوية. تحضير الكواشف لجمع الأنسجة وتثبيتها ، مثل 70٪ إيثانول في الماء ، و DPBS مبرد إلى أربع درجات مئوية ، ومخزن Bouin المثبت ، و 10٪ فورمالين مخزن. بعد ذلك ، قم بإعداد المعدات اللازمة ، مثل مجموعة تشريح الفئران ، وأطباق بتري ، وإبرة تزويج قياس 16 متصلة بحقنة سعة 10 ملليلتر وأشرطة نسيجية.
قبل يومين من التعرض لأشعة غاما ، قم بإعداد التجارب لحقن عقار تاموكسيفين. وزن كل ، وحساب الجرعة المطلوبة. تطهير منطقة البطن مع 70 ٪ من الإيثانول.
بعد ذلك ، يتم تطبيق جرعة واحدة من عقار تاموكسيفين داخل الصفاق باستخدام إبرة قياس 27 متصلة بحقنة سعة ملليلتر واحد للحث على إعادة التركيب بوساطة Cre. راقب الحيوانات لمدة 48 ساعة القادمة لاستبعاد سمية عقار تاموكسيفين المحتملة. بعد 48 ساعة ، انقل الحيوانات إلى غرفة التشعيع.
تطهير غرفة العينة في مشع جاما بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪. ضع حصيرة الامتصاص والحيوانات داخل غرفة العينة. ضع الغطاء وأغلق الغرفة.
قم ببرمجة جهاز تشعيع جاما لتعريض الحيوانات ل 12 تشعيعا رماديا إجماليا للجسم. بعد ذلك ، أدر المفتاح إلى موضع البدء ، واضغط على Start لبدء التعرض. اترك الغرفة لوقت التعرض النشط.
بعد انقضاء الوقت المحدد مسبقا ، سيتوقف الجهاز تلقائيا وسيبدأ في إصدار صفير. قم بإيقاف تشغيل الجهاز عن طريق تحويل المفتاح إلى وضع الإيقاف. افتح حجرة العينة وانزع الغطاء.
نقل الحيوانات إلى القفص ، وتطهير غرفة العينة مع 70 ٪ من الإيثانول. نقل الحيوانات مرة أخرى إلى غرفة السكن التقليدية ، ومراقبة حالتها بعد العلاج. مراقبة وزن الحيوانات كل يوم.
قبل ثلاث ساعات من القتل الرحيم المخطط له ، قم بتطهير منطقة البطن ، وحقن الفئران داخل الصفاق ب 100 ميكرولتر من محلول مخزون EdU باستخدام حقنة أنسولين قياس 28. بعد القتل الرحيم للحيوان ، اجمع الأمعاء القريبة في نقاط زمنية مختلفة بعد التشعيع. تشريح الجزء القريب من الأمعاء الدقيقة ، وإزالة الأنسجة المرفقة.
اغسل الأنسجة باستخدام DPBS البارد باستخدام إبرة تغذية مستقيمة قياس 16 متصلة بحقنة سعة 10 ملليلتر ، وقم بتثبيت المنديل باستخدام المخزن المؤقت المثبت ل Bouin. قطع الأمعاء مفتوحة طوليا ، ولف الأمعاء القريبة باستخدام تقنية Swiss-roll. ضع الأنسجة في كاسيت نسيجي في وعاء يحتوي على 10٪ من الفورمالين المخزن ، واحتضانه لمدة 24 إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
بعد الحضانة ، انقل الكاسيتات النسيجية إلى 70٪ إيثانول ، وقم بتضمين الأنسجة في البارافين. بعد التضمين ، ضع الكاسيتات النسيجية على الجليد لمدة ساعة على الأقل. ثم ، قم بقطع مقاطع أفقية بسمك خمسة ميكرون باستخدام ميكروتوم.
انقل أقسام الأنسجة إلى حمام مائي دافئ حتى 45 درجة مئوية ، وضع الأقسام على شرائح مشحونة. اترك الشرائح على رف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة حتى تجف. أظهرت صور الهيماتوكسيلين ويوزين لعينات الأمعاء الدقيقة ظهارة معوية متجانسة عند ساعة الصفر ، تليها فقدان الخلايا داخل مقصورات القبو خلال مرحلة موت الخلايا المبرمج.
تبع ذلك مرحلة التجدد التي ملأت فيها الخلايا التكاثرية للغاية الخبايا ، مما أدى إلى مرحلة التطبيع بحلول اليوم السابع. أظهر تتبع النسب بواسطة EYFP أنه أثناء التوازن ، اقتصرت الخلايا الناشئة من الخلايا الجذعية الاحتياطية الإيجابية Bmi1 على مواقع زائد أربعة إلى زائد ستة داخل الخبايا. أظهر تلطيخ EdU و Ki-67 توازنا معويا طبيعيا في الفئران المشععة الوهمية ، ويمتد من الخلايا الجذعية النشطة عبر منطقة تضخيم العبور.
خلال مرحلة موت الخلايا المبرمج ، انخفض عدد الخلايا الإيجابية ل EYFP ، مصحوبا بفقدان الخلايا التكاثرية الناجمة عن التلف الإشعاعي. في مرحلة التجدد ، لوحظ تنشيط الخلايا الجذعية الاحتياطية والانتشار السريع للخلايا الإيجابية Bmi1. مزيد من الانتشار والهجرة استعادة سلامة ظهارة الأمعاء.
أظهر تلطيخ TUNEL أن الخلايا المبرمج غائبة أثناء التوازن. لوحظت زيادة في تلطيخ TUNEL في وقت متأخر من مرحلة موت الخلايا المبرمج. خلال مرحلة التجدد ، انخفض تلطيخ TUNEL بشكل مطرد داخل الخبايا المتجددة وكان غائبا تقريبا عندما تم تطبيع الخبايا.
يمكن دمج هذه التقنية مع تسلسل الحمض النووي الريبي ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، أو فرز الخلايا المنشط بالتألق ، أو التحليل البروتيني لاستخلاص المزيد من المعرفة المتعمقة حول دور سلالات خلايا معينة أثناء تجديد الأمعاء بعد الإصابة. يمكن للباحثين التحقيق في التفاعلات بين الجراثيم ومجموعات الخلايا الظهارية واللحمية والمناعية في تجديد الأمعاء لتوسيع فهم القدرة التجديدية لظهارة الأمعاء.
