في الجسم الحي التصوير للأنسجة البيولوجية مع القرار تحت الخلوي والخصوصية الكيميائية هو أداة قوية لفهم العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها التمثيل الغذائي الخلوي، والاستجابة المناعية، وإعادة تشكيل الأنسجة. مع التألق ثنائي الفوتون المشترك وتحفيز المجهر المبعثر رامان ، يمكن الحصول على المعلومات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية الهامة للأنسجة البيولوجية من وجهات نظر متعددة بدقة دون الخلايا. على وجه التحديد ، يمكن استخدام هذا الفحص المجهري ثنائي الوسائط لتصوير الديناميكيات الخلوية والتفاعلات في الحبل الشوكي للفأر لدراسة تطور الأمراض العصبية التنكسية وإصابة الحبل الشوكي.
للبدء ، قم بتشغيل ليزر الياقوت التيتانيوم عن طريق تبديل مفتاح المفتاح من وضع الاستعداد إلى وضع التشغيل وانتظر لمدة 30 دقيقة حتى يسخن الليزر. ثم قم بتشغيل OPO بالنقر فوق زر البدء في لوحة تحكم OPO وانتظر لمدة 20 دقيقة حتى يسخن الليزر. بعد تسخين ليزر بيكو ثانية ، تحقق من عمق التعديل لشعاع ستوكس عن طريق خفض قوة شعاع ستوكس إلى حوالي 20 مللي واط ، وفتح مصراع الليزر لشعاع ستوكس ووضع كاشف صور عالي السرعة عند مخرج OPO للكشف عن الشعاع.
بعد ذلك ، قم بتوصيل منفذ الإخراج الخاص بكاشف الصور بمنفذ الإدخال الخاص بمنظار الذبذبات باستخدام كابل محوري مع موصل BNC لمراقبة نبضة الليزر. ثم افتح نافذة التحكم في EOM في برنامج التحكم OPO واضبط طاقة EOM وطورها وفقا لمخطط كثافة النبض الموضح على الذبذبات لتحقيق أقصى عمق تعديل عند 20 ميجاهرتز. في برنامج التحكم OPO ، افتح مصراع ليزر المضخة أثناء إيقاف إخراج Stokes.
بعد ذلك ، انقر فوق مربع الإشارة المحدد لضبط الطول الموجي لشعاع المضخة على 796 نانومتر ، ثم انقر فوق مربع طاقة OPO المحدد وأدخل 20 لضبط طاقته على الحد الأدنى للمحاذاة البصرية. بعد ذلك ، ضع لوحة المحاذاة P1 خلف مقسم شعاع الاستقطاب عند حوالي 10 سم ووضع اللوحة P2 خلف P1 عند حوالي 30 سم على المسار البصري. بعد فتح مصراع المجهر لشعاع ليزر بيكو ثانية ، اضبط المرآة M1 لتحديد موقع مركز شعاع ليزر بيكو ثانية في الفتحة من خلال P1. استخدم منظار الأشعة تحت الحمراء لمراقبة موضع بقعة الشعاع عند P1 عند ضبط المرآة M1. وبالمثل ، اضبط المرآة M2 لتحديد موقع مركز شعاع ليزر بيكو ثانية في الفتحة العرضية P2. استخدم نطاق الأشعة تحت الحمراء لمراقبة موضع بقعة الشعاع عند P2 عند ضبط المرآة M2. بعد ضبط المرايا حتى يقع مركز شعاع بيكو ثانية في الفتحة من خلال كل من لوحات المحاذاة ، أغلق مصراع شعاع بيكو ثانية في برنامج التحكم المجهري.
بعد ذلك ، افتح مصراع المجهر لشعاع ليزر الفيمتو ثانية. اضبط المرآة M3 لتحديد موقع مركز بقعة شعاع ليزر الفيمتو ثانية في الفتحة العرضية P1 ، ثم اضبط المرآة M4 لتحديد موقع مركز بقعة شعاع الليزر الفيمتو ثانية في الفتحة من خلال P2. بعد ضبط المرايا حتى يقع مركز شعاع ليزر الفيمتو ثانية عند الثقوب من خلال لوحين المحاذاة ، أغلق مصراع المجهر لشعاع الفيمتو ثانية. بعد ذلك ، ضع كاميرا في موضع الهدف لتصور موقع نقطتي الشعاع ووضع علامة على موضع شعاع المضخة على شاشة الكاميرا كمرجع.
ثم ضع لوحة محاذاة P0 قبل العدسة L3 واضبط المرآة البصرية باستخدام مفتاح سداسي عشري بحيث يمر مركز شعاع ستوكس عبر ثقب لوحة المحاذاة في منفذ إخراج الليزر. استخدم نطاق الأشعة تحت الحمراء لتأكيد موضع بقعة الشعاع عند P0 أثناء الضبط. بعد ذلك ، قم بإزالة لوحة المحاذاة P0 واستخدم المفتاح السداسي لضبط المرآة البصرية الثانية بحيث يتشارك مركز شعاع Stokes في تحديد موقعه مع العلامة المرجعية لشعاع المضخة على الكاميرا.
استمر في ضبط المرايا حتى يتداخل شعاع ستوكس بشكل صارم مع شعاع المضخة في كل من P0 وطائرات الكاميرا. افتح برنامج التحكم في مضخم الصوت واضبط الطول الموجي لليزر المضخة على 796 نانومتر وقوة المضخة وشعاع ستوكس على 50 و 70 مللي واط المقابلة ل 15 و 25 مللي واط على العينة على التوالي. ثم استخدم زيت الزيتون لتحسين مرحلة مكبر الصوت المقفل.
يتم ختم زيت الزيتون في شريحة مع المناديل الورقية المرفقة في الجزء السفلي لتعزيز تشتت الإشارة مرة أخرى أو الكشف عن EPI-SRS. ضع عينة زيت الزيتون على المسرح واضبط تركيز هدف 25X على العينة. باستخدام برنامج التحكم في المجهر ، قم بتعيين معلمات التصوير كما هو مذكور في مخطوطة النص.
ثم باستخدام برنامج التحكم في مضخم الصوت ، اضبط القيمة الثابتة للوقت على 10 ميكروثانية. بعد ذلك ، قم بمسح شعاع الليزر فوق العينة ، وضبط المرحلة بحجم خطوة يبلغ 22.5 درجة حتى تصل شدة إشارة SRS إلى الحد الأقصى. ثم امسح العينة ضوئيا مع إغلاق مصراع الليزر، وضبط قيمة الإزاحة بحجم خطوة واحد مللي فولت حتى يقترب متوسط إشارة SRS من الصفر.
بعد ذلك ، افتح مربع حوار مدير التأخير في برنامج التحكم OPO وقم بمسح زيت الزيتون ، وضبط مرحلة التأخير حتى تصل إشارة SRS لزيت الزيتون إلى الحد الأقصى. ثم توقف عن المسح الضوئي وانقر على زر إضافة بيانات في مربع حوار مدير التأخير لتسجيل بيانات التأخير الحالية. بعد الحصول على بيانات تأخير مماثلة في نوبات رامان المختلفة عن طريق تصوير عينات كيميائية مختلفة ، حدد البيانات المناسبة بالترتيب خمسة في مربع حوار مدير التأخير لتناسب نقاط البيانات الحالية مع الدالة متعددة الأسماء من الدرجة الخامسة.
ثم قم بتطبيق البيانات المجهزة بالنقر فوق الزر "استخدام كمخصص" وتحديد خانة الاختيار. يتم ضبط مرحلة التأخير تلقائيا بأطوال موجية مختلفة وفقا لمنحنى التأخير المجهز. للتصوير في الجسم الحي ، قم بإصلاح الماوس في مرحلة التثبيت مع تعرض الحبل الشوكي وغمره في محلول ملحي.
الآن قم بتركيب مرحلة التثبيت على مرحلة من خمسة محاور تحت مجهر TPEF-SRS. ثم قم بتأمين رأس الماوس بقضيبي رأس وخفض لوحة الإمساك لتوفير مساحة كافية لحركة الصدر أثناء التنفس ، مما يخفف من التحف الحركية. بعد ذلك ، اضبط المرحلة الانتقالية Z لضبط التركيز حتى يمكن ملاحظة صورة Brightfield للأوعية الدموية في الحبل الشوكي تحت هدف 10X.
حدد موقع الوريد الظهري للحبل الشوكي في مركز مجال الرؤية عن طريق ضبط المرحلة الانتقالية ذات المحورين للمرحلة ذات المحاور الخمسة. بعد ذلك ، اضبط زوايا اللفة والملعب لمرحلة المحاور الخمسة لضبط السطح الظهري للحبل الشوكي عموديا على المحور الموضوعي استنادا إلى صورة Brightfield. ثم استبدل 10X بهدف غمر الماء 25X لتصوير TPEF-SRS.
بالنسبة لتصوير SRS، حدد فاصل شعاع الاستقطاب فوق الهدف عن طريق الضغط على زر التبديل المتصل بالزعانف المزودة بمحرك. لتصوير TPEF ، حدد المرآة ثنائية اللون D2 فوق الهدف عن طريق الضغط على زر التبديل المتصل بالزعانف الآلية. وأخيرا، اضبط معلمات التصوير كما هو موضح في مخطوطة النص وابدأ في مسح العينة.
في الجسم الحي ، كشف التصوير ثنائي الوسائط لمحاور YFP ذات العلامات المتناثرة وأغماد المايلين في الحبل الشوكي للفأر أن المحاور ملفوفة عن كثب بواسطة طبقة سميكة من أغماد المايلين. كما يتضح من صورة الحبل الشوكي TPEF-SRS ، انخفضت عقد رانفييه من القطر المحوري ويتعرض المحور مباشرة للمصفوفة خارج الخلية. جنبا إلى جنب مع تحقيقات جديدة للتألق والتصوير SRS اثنين من الفوتون الإثارة التألق المجهري SRS يمكن أن يحقق التصوير الهيكلي والوظيفي في وقت واحد من مختلف الجزيئات الحيوية، مما يسهل فهمنا للعمليات البيولوجية المعقدة.
