يعد اختبار التشنج المجهري للخلايا الباست أداة قوية لدراسة التشكل الدائري متعدد الخلايا في تطور المرض. ومن المهم أيضا لبحوث الخلايا. نظام النمط الكلي هذا سهل التصنيع والاستخدام ، وهو قادر على إنتاج نتائج موثوقة للغاية وقابلة للتكرار ، كما أنه متوافق مع المعالجة التلقائية عالية الإنتاجية لحجم العينة الكبير.
ابدأ بقطع الشريحة المطلية بالذهب من التيتانيوم إلى قطع مربعة صغيرة تبلغ مساحتها حوالي 12 × 12 ملم. باستخدام قاطع زجاجي ، انزلق عبر السطح لترك مسار مسنن ، ثم أمسك الشريحة الزجاجية على كلا الجانبين وانحني عند الانحناء لاقتحام أرباع صغيرة. لتنظيف الشريحة ، انقعها مع الجانب الذهبي في الإيثانول بنسبة 100٪ الموجود في طبق بتري على شاكر مداري لمدة 10 دقائق على الأقل.
بعد شفط الإيثانول ، جفف الشريحة عن طريق النفخ بتيار النيتروجين. نظف طوابع polydimethylsiloxane أو PDMS بالماء والصابون قبل تجفيف الختم بغاز النيتروجين. قم بإذابة 5.74 ملليغرام من أوكتاديكانيثيول أو C18 في 10 ملليلتر من الإيثانول بنسبة 100٪ لصنع محلول C18 ملليمولين ، ثم قم بتنظيف طوابع PDMS باستخدام 100٪ إيثانول.
انقع ختم PDMS مع سطح النمط المواجه لأسفل في محلول C18 لمدة 10 ثوان ثم جففه بلطف بغاز النيتروجين لمدة 60 ثانية. بمجرد تجفيفه ، ضع الختم متجها لأسفل على الشريحة الذهبية لمدة 60 ثانية قبل الإزالة. لضمان الختم السليم ، انقر برفق على الملقط على الختم لنقل الأنماط بشكل صحيح.
بعد ذلك ، قم بإعداد غرف الرطوبة عن طريق سحب ملليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول في غطاء طبق بتري مقلوب. وباستخدام الملقط ، ضع قطعة من البارافيلم لتغطية السطح لضمان عدم بقاء فقاعات. إزالة الإيثانول الزائد إذا لزم الأمر.
أضف 40 قطرة ميكرولتر من محلول EG3 لكل شريحة زجاجية ربع سنوية على البارافيلم في غرفة الرطوبة ، مع ترك مساحة كافية بين القطرات لحساب تباعد الشرائح الذهبية. استخدم الملقط لوضع شريحة الذهب المطبوعة C18 متجهة لأسفل على القطرة، مما يضمن عدم بقاء أي فقاعات تحت الشريحة. ادفع الشرائح معا برفق دون رفعها لتقليل التبخر.
بعد إغلاق طبق بتري بإحكام باستخدام البارافيلم ، اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل. في خزانة السلامة الأحيائية ، انقع وشطف شريحة الذهب التي تواجه ثلاث مرات في 70٪ من الإيثانول لإزالة EG3 ، ثم اتركها في الإيثانول لمدة 10 دقائق للتعقيم. بعد شفط الإيثانول ، أضف PBS معقمة.
قم بإعداد غرفة رطوبة أخرى باستخدام PBS بدلا من الإيثانول كما هو موضح. بعد ذلك ، أضف 50 قطرة ميكرولتر من محلول الفيبرونيكتين لكل ربع شريحة على البارافيلم ، تاركا بعض المساحة بين القطرات. ثم ضع الشريحة متجهة لأسفل على القطيرة كما هو موضح سابقا واترك طبق بتري في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة.
بعد شطف الشريحة المطلية بالذهب ثلاث مرات، ضع الشريحة متجهة لأعلى في PBS. قبل بذر الخلايا ، قم بتسخين الوسائط والتريبسين في حمام مائي خفف من درجة حرارة 37 درجة مئوية. للحصول على ملحق خلية أفضل، انقع شريحة النمط في صفيحة من 12 بئرا تحتوي على وسائط استزراع وقم بتسخينها عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
بمجرد أن يتم تربسين الخلايا ، قم بتحييد الخلايا باستخدام FBS التي تحتوي على وسائط ، وقم بتكسير الخلايا بسرعة 100 مرة G لمدة ثلاث دقائق ثم أعد تعليق حبيبات الخلايا في وسائط جديدة. عد الخلايا وقم بتخفيف تعليق الخلية لتحقيق تركيز 200،000 خلية لكل ملليلتر. أضف 0.5 ملليلتر من تعليق الخلايا إلى كل بئر يحتوي على شريحة ذهبية واحدة.
رج الطبق بلطف عدة مرات لبذر الخلايا بشكل موحد قبل احتضانها لمدة 15 دقيقة لتركيب الخلية. بعد 15 دقيقة ، تحقق من مرفق الخلية تحت المجهر ، وإذا لزم الأمر ، احتضن لبعض الوقت. بمجرد ربط الخلايا ، قم بسحب الوسائط التي تحتوي على خلايا غير متصلة من كل بئر وأضف ملليلتر واحد من وسائط الثقافة الطازجة.
قم بزراعة الخلايا في الحاضنة لمدة 24 ساعة وتحقق من الالتقاء لتحديد ما إذا كانت chirality قد تشكلت. عندما يتم تحقيق الالتقاء المطلوب ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إزالة وسائط الثقافة. بعد الشطف باستخدام PBS مرة واحدة ، أضف محلول بارافورمالدهيد 4٪ إلى الشريحة واحتضن درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل الشطف مرة أخرى باستخدام PBS ثلاث مرات.
للحصول على الصور، استخدم مجهر تباين الطور مع وظائف الكاميرا والتقط كل حلقة على الشريحة بدقة عالية. لتوصيف chirality ، قم بتنزيل ملفات التعليمات البرمجية MATLAB ، وأضف مجلد التعليمات البرمجية والمجلدات الفرعية إلى مسار MATLAB وافتح ROI_selection. م ملف.
في السطر الرابع، قم بتغيير الدليل إلى مجلد البيانات المطلوب. قم بتغيير حجم الصورة في السطر 14 مع أول شكلين يمثلان حجم الدائرة الداخلية للحلقة بينما يمثل الشكلان الآخران الشكل الخارجي. لتحديد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار في صور تباين المرحلة، قم بتنفيذ التعليمات البرمجية MATLAB ROI_selection.
m بالنقر فوق الزر تشغيل. اسحب مربع التحديد يدويا لاحتواء الحلقة، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق الصورة لتأكيد التحديد. بعد تحديد عائد الاستثمار من جميع الصور الموجودة في المجلد ، سيتم إنشاء ملف حصيرة لتخزين معلومات عائد الاستثمار لكل صورة.
ثم افتح analysis_batch. m ملف وتغيير دليل المجلد كما هو موضح من قبل. انقر فوق الزر "تشغيل" لتنفيذ التعليمات البرمجية analysis_batch.
m لتحديد التناغم بين أنماط الحلقات الخلوية المتعددة. A datatoexcel. سيتم إنشاء ملف txt يحتوي على إحصائيات دائرية لكل حلقة ، بالإضافة إلى أرقام الحلقات غير الدائرية في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة.
تظهر النتائج الحالية فائدة اختبار نمط الحلقة المطور تجريبيا بالإضافة إلى حساسية هذا الفحص للتغيرات في الهيكل الخلوي. في هذه الدراسة ، وجد أنه من خلال تعطيل بلمرة الأكتين باستخدام 50 نانومولار لاترونكولين A ، أظهرت خلايا الفأر Myoblast C2C12 تغييرا في التحيز الدائري عكس اتجاه عقارب الساعة أو CCW إلى اتجاه عقارب الساعة أو CW.In بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الخلايا البطانية الوعائية السرية البشرية أو hUVECs التي عولجت ب 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate أو TPA لتنشيط بروتين كيناز C تحولا يعتمد على الجرعة من chirality الخلايا من CW إلى CCW. بعد بذر الخلايا إلى الأنماط ، يمكن استكمال المواد الكيميائية أو الأدوية إلى الوسط لدراسة الاستجابة ، ويمكن دمج نظام transwell لدراسة الزراعة المشتركة للخلايا.
يوفر هذا الفحص أداة فعالة للتحقيق في الجيرالية متعددة الخلايا في ظل إعدادات تجريبية مختلفة تقدم رؤى مهمة حول دور الخلية في مختلف الظواهر والعمليات البيولوجية.
