توفر الفحوصات المستندة إلى TR-FRET أدوات جديدة فعالة من حيث التكلفة للفحص والتوصيف الدوائي للمعدلات المحددة والانتقائية لمسارات إشارات JAK / STAT. هذه التقنية أسهل بكثير وسريعة وقابلة للتكرار وقوية من الطرق التقليدية مثل اللطخة الغربية و ELISA. لا توجد خطوات غسيل مطلوبة ويتم إضافة الكواشف في خطوة واحدة.
يمكن تطبيق منصة المقايسة المناعية هذه بسهولة على بروتينات إشارات الخلايا الأخرى بشرط توفر أجسام مضادة محددة. لتصميم مقايسات قابلة للتكرار ، يجب عليك استخدام ممارسات زراعة الخلايا الجيدة ووضع إجراءات تشغيل قياسية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب عليك تحسين زراعة الخلايا وظروف العلاج بعناية.
ستوضح الإجراء جينيفيف شاتيل ، وهي عالمة من مختبرنا. للبدء ، استزرع خلايا HeLa و A431 في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون باستخدام DMEM مع استكمال 10٪ FBS. عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ من الالتقاء ، قم بالتربسين بها وإما مرورها أو استخدامها للمقايسات.
لإجراء الفحص ، قم بتوزيع 50 ميكرولتر من الخلايا بالكثافة المحسنة مسبقا في صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة من 96 بئرا في وسط الثقافة المناسب ، ثم احتضنها بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإعداد سلسلة تخفيف متوسطة مزدوجة وأربعة أضعاف لمركبات الاختبار عن طريق تخفيف المركب بشكل متسلسل في وسط خال من المصل عبر 12 بئرا من صفيحة البولي بروبيلين 96 بئرا. لتحفيز الخلايا ، أضف 50 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على جهاز المحاكاة بتركيز 2X واحتضن الخلايا للوقت الأمثل مسبقا إما في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة.
لتثبيط الخلايا ، أضف 25 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على المثبط بتركيز 4X واحتضن الخلايا للوقت الأمثل مسبقا إما في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة ، ثم أضف 25 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على المحفز بتركيز 4X واحتضنه للوقت الأمثل مسبقا. بعد ذلك ، لتحليل الخلايا ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل المكمل 1X وإضافة كوكتيل مثبط الفوسفاتيز إليه. بعد إزالة والتخلص بعناية من وسط زراعة الخلايا ، أضف على الفور 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المكمل 1X المحضر واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت الاهتزاز مع إثارة معتدلة.
للكشف عن TR-FRET ، قم بإعداد مزيج الكشف عن الأجسام المضادة 4X في المخزن المؤقت للكشف عن 1X ، ثم قم بإعداد حلول الأجسام المضادة EUAB1 و FRAB2 ، بالإضافة إلى حلول الأجسام المضادة EUAB3 و FRAB4 في المخزن المؤقت للكشف عن 1X. وأخيرا، امزج EUAB1 المخفف مسبقا مع FRAB2 المخفف مسبقا للكشف عن بروتين الفوسفو و EUAB3 المخفف مسبقا و FRAB4 المخفف مسبقا للكشف عن البروتين الكلي. ثم قم بماصة 15 ميكرولتر من الخلية المحللة بعناية من لوحة الثقافة المكونة من 96 بئرا إلى بئر من صفيحة صغيرة بيضاء منخفضة الحجم بحجم 384 بئرا.
بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من محللات التحكم الإيجابية و 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 1X كعنصر تحكم سلبي لفصل آبار الفحص. إلى الآبار التي تحتوي على 15 ميكرولتر من الليزات ، أضف خمسة ميكرولترات من مزيج الكشف عن الأجسام المضادة 4X المقابل للكشف عن بروتين الفوسفو أو البروتين الكلي. بعد تغطية اللوحة بسدادة لوحة ، احتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بين عشية وضحاها اعتمادا على مجموعة الفحص.
بعد اكتمال الحضانة ، قم بإزالة مانع تسرب اللوحة اللاصقة وقراءة اللوحة على قارئ microplate متوافق مع TR-FRET. يتم تمثيل نتائج فحوصات TR-FRET للكشف عن الفوسفو-STAT1 وتحديده كميا مع إجمالي STAT1 و phospho-STAT4 في خلايا U266B1 جنبا إلى جنب مع phospho-STAT5 مع إجمالي STAT5 في خلايا A431 باستخدام منحنيات استجابة التركيز. وبالمثل ، يتم تمثيل اختبارات TR-FRET للكشف عن الفوسفو STAT3 وإجمالي STAT3 و phospho-STAT6 وإجمالي STAT6 وتحديده كميا باستخدام منحنيات استجابة التركيز.
وعموما، أظهرت جميع الفحوص إشارات TR-FRET قوية، ونطاقات ديناميكية واسعة، وتباين معامل منخفض بين الآبار، ونسب إشارة إلى خلفية مقبولة. وأظهرت معالجة الخلايا بمنشطات JAK والإنترفيرون ألفا-2B وIL-4 وEGF الزيادة المتوقعة المعتمدة على التركيز في فسفرة STAT في بقايا التيروزين المحددة، في حين ظلت البروتينات الكلية STAT المقابلة مستقرة. كل من مثبط JAK و erlotinib يثبطان مستويات الفوسفو ستات المقابلة بطريقة تعتمد على التركيز.
وكانت نتائج التحفيز الفوسفو-STAT4 بواسطة الإنترفيرون ألفا-2B في خط خلية معلقة أو التحفيز الفوسفو-STAT6 بواسطة IL-4 في خط خلية التصاق باستخدام بروتوكول الصفيحة الواحدة متسقة مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول الصفيحتين، مما يدل على القدرة الناجحة على التكيف مع بروتوكول نقل صفيحتين إلى بروتوكول بئر الكل في واحد من صفيحة واحدة. تظهر نتائج دراسة التباين داخل اللوحة لفحص الفوسفو-STAT1 باستخدام خط خلية معلقة وفحص الفوسفو-STAT3 باستخدام خط خلية الالتصاق متانة هذه الفحوصات الفوسفو-ستات لتطبيقات HTS. من الضروري استكمال المخزن المؤقت للتحلل بكوكتيل مثبط الفوسفاتيز لمنع إزالة الفسفرة من البروتينات المفسفرة من الفوسفاتيز النشط الموجود في مستخلص الخلية بأكملها.
