تقلل طريقة الحث الذاتي الخالية من الخلايا من إشراف الباحث والوقت اللازم لإنتاج مستخلصات الخلايا الوظيفية. هذا يبسط بروتوكولات تخليق البروتين السابقة في المختبر التي كانت أكثر استهلاكا للوقت ومكثفة. هذه التقنية أقل تعقيدا وعالية الإنتاجية أيضا ، مما سيمكن جمهورا أكبر من تنفيذ التعبير الخالي من الخلايا.
تسلط هذه الطريقة الضوء على أهمية استقلاب الطاقة أثناء نمو الخلايا وضمن التفاعلات الخالية من الخلايا. ابدأ بإعداد 960 ملليلتر من وسائط الحث التلقائي الخالية من الخلايا. ثم قم بتعقيم الوسائط في قارورة محيرة سعة 2.5 لتر عن طريق التعقيم لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
بعد ذلك ، بعد تحضير 40 ملليلتر من محلول السكر ، قم بتصفيته وتعقيمه في وعاء زجاجي معقم منفصل. بعد التعقيم ، عندما تبرد وسائط الثقافة إلى أقل من 40 درجة مئوية ، أضف محلول السكر المعقم بالمرشح مباشرة إلى الوسائط. بعد ذلك ، قم بتلقيح الوسائط عن طريق تمرير حلقة مليئة بالمستعمرات من لوحة نجوم E.coli BL21 الطازجة التي تم خطها مسبقا وإدخال الحلقة مباشرة في الوسائط.
قم بتدوير الحلقة في الوسائط دون لمس جوانب الحاوية. ثم ، ضع الوسائط الملقحة بين عشية وضحاها في حاضنة 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بحصاد الخلايا عن طريق نقل لتر واحد من الوسائط إلى زجاجة طرد مركزي سعة لتر واحد والطرد المركزي بسرعة 5000 مرة من G بين أربع إلى 10 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد التخلص من السوبرناتانت ، استخدم ملعقة معقمة لنقل الكريات إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا ووزن 50 ملليلتر. بعد ذلك ، اغسل الكريات مرة واحدة باستخدام 30 إلى 40 ملليلتر من المخزن المؤقت S30 البارد عن طريق تعليق الكريات عن طريق الدوامة في رشقات نارية مدتها 30 ثانية مع فترات راحة على الجليد. بعد إنعاش الكريات بالكامل ، قم بالطرد المركزي لإعادة تعليق الخلية ، وتخلص من السوبرناتانت ، وباستخدام منديل نظيف ، امسح أي مادة زائدة من الجدران الداخلية لأنبوب 50 ملليلتر دون لمس الكرية.
ثم قم بوزن الكريات قبل تجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من الاستخدام. لتحضير مستخلص الخلية ، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت S30 لكل غرام من حبيبة الخلية المجمدة واترك الكريات تذوب على الجليد لمدة 30 إلى 60 دقيقة. ثم ، أعد تعليق الكريات المذابة عبر الدوامة في رشقات نارية مدتها 30 ثانية مع فترات راحة على الجليد حتى لا تبقى كتل خلايا مرئية.
بالنسبة لتحلل الخلايا ، انقل 1.4 ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنابيب microfuge سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بسونيك تعليق الخلية في كل أنبوب بتردد 20 كيلوهرتز وسعة 50٪ لمدة ثلاث رشقات نارية من 45 ثانية مع 59 ثانية من الراحة لكل دورة في حمام جليدي عكس الأنبوب بين الدورات ، وبعد دورة الصوتنة الأخيرة ، أضف على الفور 4.5 ميكرولتر من ثنائي ثيوثريتول واحد مولار. بعد صوتنة تعليق الخلية في جميع الأنابيب ، قم بالطرد المركزي للأنابيب وجمع supernatant في أليكوت سعة 600 ميكرولتر في أنابيب microfuge جديدة سعة 1.5 ملليلتر.
قم بتجميد الفلاش وتخزين الأليكوتس عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من الاستخدام. لإجراء 15 ميكرولتر من تفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا في أنابيب microfuge سعة 1.5 ملليلتر في أربعة أضعاف ، قم بإذابة أليكوت واحد من مستخلص الخلية. بعد تحضير كل خليط تفاعل سعة 15 ميكرولتر، اسمح للتفاعل بالعمل لمدة أربع ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية.
لتحديد كمية البروتين المراسل ، اجمع 48 ميكرولتر من مخزن HEPES العازل 50 ملليمولار عند درجة الحموضة 7.2 مع ميكرولترين من كل منتج تفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا في صفيحة سوداء من البوليسترين 96 بئرا. حدد كثافة التألق للبروتين الفلوري الأخضر الفائق ، أو sfGFP ، باستخدام طول موجي مثير يبلغ 485 وطول موجي للانبعاثات يبلغ 528 نانومتر. بعد ذلك ، قم بتحويل وحدات التألق النسبية إلى العائد الحجمي ل sfGFP عن طريق إنشاء منحنى قياسي باستخدام بلازميد pJL1 sfGFP المنقى .
تظهر هنا كريات وسائط الحث الذاتي الخالية من الخلايا بعد حصاد الخلايا بكثافات بصرية مختلفة تقاس عند 600 نانومتر. نمت الوسائط إلى كثافة بصرية من 10 أنتجت كمية أكبر من بيليه الخلية في المستخلص الكلي من الوسائط نمت إلى كثافة بصرية من 2.5. أظهر مزيد من التحليل لتركيز البروتين الكلي عدم وجود فرق كبير في البروتين الكلي بين كلا المستخلصين.
على الرغم من أن الوسائط نمت إلى مستويات كثافة بصرية مختلفة ، إلا أن كلا المستخلصين أظهرا نتائج مماثلة في تفاعلات خالية من الخلايا تعبر عن sfGFP. من المهم الحفاظ على ظروف معقمة أثناء إعداد الوسائط ومحلول السكر. يمكن استخدام طريقة استخراج الخلايا CFAI هذه لمعظم تطبيقات التعبير الخالي من الخلايا.
وتتراوح هذه من تعليم التكنولوجيا الحيوية إلى هندسة البروتين، فضلا عن التشخيص في نقاط الرعاية. تقلل هذه الطريقة من مقدار الوقت والمهارة التقنية المطلوبة ، وتحسن قابلية الاستنساخ ، وتنتج كميات أكبر من المستخلص.
