تجمع هذه المنهجية بين تحسين بروتوكول المقاصة وقدرة العين على التقسيم البصري لتقنية Mesos PIM مما يسمح لنا بإجراء عمليات إعادة بناء متوسطة المنظار بدقة ميكرومترية. يوفر إمكانية تصوير أنسجة القلب الضخمة أو حل قلوب الفأر بالكامل في مسح واحد دون فقدان تنظيم الأنسجة ثلاثي الأبعاد الأصلي. بعد أن يتم تقليب القلب بواسطة الشريان الأورطي القريب المغسول في محلول تيرو وتثبيته في 4٪ ألدهيد بارافورم في 0.01 مولار PBS ، يكون جاهزا لبدء بروتوكول المقاصة.
اغسل القلب ثلاث مرات في 0.01 مولار PBS عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين القلب في PBS و 0.01٪ أزيد الصوديوم عند أربع درجات مئوية لعدة أشهر. احتضان القلب في 20 ملليلتر من محلول هيدروجيل في حالة اهتزاز عند 15 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثة أيام عند أربع درجات مئوية.
قم بإزالة الغاز من العينة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجفف ومضخة تفريغ ونظام أنبوب يربط المجفف بكل من شريط المضخة وخط أنابيب النيتروجين. ضع العينة في المجفف وافتح القارورة مع إبقاء الغطاء عليها. أغلق المجفف وأزل الأكسجين من الأنبوب عن طريق فتح خط أنابيب النيتروجين.
قم بتشغيل مضخة التفريغ لإزالة الأكسجين من المجفف لمدة 10 دقائق. قم بإيقاف تشغيل المضخة وافتح مقبض المجفف إلى خط أنابيب النيتروجين. ثم افتح صنبور النيتروجين.
بمجرد أن يكون الضغط مساويا للضغط الجوي ، افتح المجفف بعناية وأغلق القارورة بسرعة. احتفظ بالقلب في محلول هيدروجيل منزوع الغازات عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تقريبا في حالة راحة. عندما يتم بلمرة الهيدروجيل بشكل صحيح ويبدو جيلاتينيا تماما ، قم بإزالة القلب منه بعناية ووضعه في محلول مقاصة في القارورة بمحلول تطهير.
قم بتغيير محلول المقاصة في القارورة مرة كل ثلاثة أيام لتسريع إجراء التوضيح. بمجرد أن يظهر القلب واضحا تماما ، أخرجه من القارورة واغسله في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني دافئ لمدة 24 ساعة في حالة اهتزاز. اغسل مرة أخرى في 50 ملليلتر من X PBS T لمدة 24 ساعة في حالة الاهتزاز.
احتضان العينة في 0.01 ملليغرام لكل ملليلتر جنين القمح aglutinin أرضية Alexa 633 في ثلاثة ملليلتر من واحد X PBS T في حالة اهتزاز عند 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة سبعة أيام. بعد الحضانة لمدة سبعة أيام ، اغسل العينة في 50 ملليلتر من X PBS T في درجة حرارة الغرفة في الاهتزاز لمدة 24 ساعة. احتضان العينة في 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة ثم اغسلها ثلاث مرات في 0.01 مولار PBS لمدة خمس دقائق لكل منها.
احتضان القلب على التوالي في 20 و 47٪ TDE في 0.01 PBS المولي لمدة ثماني ساعات لكل منهما. ثم أخيرا عند 68٪ TDE في 0.01 المولي PBS لتوفير معامل الانكسار المطلوب 1.46. املأ برفق حوالي 80٪ من كوارتز الكوارتز الخارجي بوسط معامل الانكسار.
املأ كوارتز الكوارتز الداخلي بنفس وسيط معامل الانكسار. اغمر العينة داخل quvet الداخلي. حرك العينة برفق إلى أسفل الكوفيت باستخدام ملاقط رفيعة ورتب القلب بمحوره الطولي الموازي للمحور الرئيسي للكوفيت لتقليل مسار ضوء الإثارة عبر الأنسجة أثناء المسح.
قم بإصلاح القابس المخصص بعناية فوق quvet الداخلي بمسمارين. قم بتركيب العينة على مرحلة المجهر باستخدام المغناطيس. قم بترجمة مرحلة العينة الرأسية يدويا لغمر quvet الداخلي في المرحلة الخارجية.
قم بتشغيل مصدر ضوء الإثارة بطول موجي يبلغ 638 نانومتر واضبطه على طاقة منخفضة في حدود ثلاثة ملي واط. حرك العينة باستخدام المترجم الآلي لإضاءة لوحة داخلية من الأنسجة. قم بتشغيل برنامج الكاميرا الحية لصورة HC واضبط مشغل الكاميرا على وضع ورقة ضوء مشغل الحافة الخارجية لدفع مشغل الاستحواذ للكاميرا بواسطة البرنامج المخصص الذي يتحكم في الإعداد بالكامل.
قم بتمكين الحفظ التلقائي في برنامج الكاميرا وقم بتعيين مجلد الإخراج حيث يجب حفظ الصور. اضبط موضع العينة يدويا في المستوى X Y باستخدام المترجمين الخطيين لنقل العينة إلى مركز مجال رؤية مستشعر الكاميرا. حرك العينة على طول المحور Z باستخدام المترجم الخطي الميكانيكي لتحديد حدود القلب لإعادة البناء المقطعي.
قم بزيادة طاقة الليزر إلى حوالي 20 ملي واط قبل البدء في جلسة التصوير. ابدأ الاستحواذ المقطعي بالنقر فوق زر البدء في لوحة الالتقاط الخاصة ببرنامج التصوير ، وفي نفس الوقت ابدأ في تحريك العينة على طول المحور Z بسرعة ثابتة تبلغ ستة ميكرومتر في الثانية باستخدام المترجم الآلي. إن الجمع بين منهجية الوضوح مع TDE كوسيط معامل الانكسار لا يغير بشكل كبير الحجم النهائي للعينة ولا يؤدي إلى تشوه الخواص للعينة.
أنتجت بصريات الإثارة ورقة ضوئية بحد أدنى من النفايات يبلغ حوالي ستة ميكرومتر تباعدت حتى 175 ميكرومتر على حافة مجال الرؤية. تضمن مزامنة مصراع الكاميرا المتداول مع المسح المحوري لنفايات ورقة الضوء جمع إشارة الانبعاث فقط في جزء العينة المتحمس مع نفايات ورقة الضوء مما يؤدي إلى متوسط F W H M يبلغ حوالي 6.7 ميكرومتر على طول مجال الرؤية بأكمله. تم أيضا تقدير وظيفة انتشار نقطة Z للمجهر من خلال إعادة بناء التصوير المقطعي للغلاف النانوي الفلوري وتم تقدير F W H M من 6.4 ميكرومتر بواسطة الملاءمة.
كما تم تأكيد قدرة النظام على حل الأغشية الخلوية المفردة في ثلاثة أبعاد مع إشارة كافية إلى نسبة الضوضاء في العضو بأكمله. إجراء إزالة الغازات هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. إذا لم يتم تنفيذه بشكل صحيح ، فقد تواجه الأنسجة أضرارا تشير أثناء الحضانة في محلول التنظيف.
يمكن دمج البروتوكول المقدم مع بروتوكول متعدد التلوين لتحقيق إعادة بناء الأعضاء بالكامل التي تدمج الهياكل البيولوجية المختلفة ويمكن تطبيقها لدراسة النماذج المرضية.
