ويرتبط كل خلية عصبية في الدماغ مع الخلايا العصبية الأخرى من قبل ما يقرب من 7000 نقاط الاشتباك العصبي. إلا أن تلك نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ الثدييات تقع أساسا على نتوءات صغيرة من الغشاء يسمى العمود الفقري التشجر. اللدونة من نقاط الاشتباك العصبي والعمود الفقري التشجر وما إلى ذلك، وظائف الدماغ الهامة مثل التعلم وعمليات الذاكرة.
من المهم ملاحظة أن المجهر الإلكتروني فقط يعطي فكرة كاملة عما إذا كان العمود الفقري التشجر له مدخلات ما بعد المتشابك. تقنيات مختلفة على التصوير العمود الفقري التشجر متاحة. ومع ذلك، كتلة المسلسل مسح الوجه المجهر الإلكتروني يعطي إمكانية فريدة من نوعها لتصوير حجم كبير من الأنسجة مع دقة عالية.
تسلسل كتلة القائم على تقنية المجهر الإلكتروني المسح يتطلب بروتوكول خاص لإعداد العينة التي تنطوي على تناقض قوي مع المعادن الثقيلة. تثبيتي الأساسي أثناء التشوه سمح لنا باستخدام نفس الأدمغة للفحص المجهري الإلكتروني المخفف. تم التضحية بالفئران وثقبها مع مثبت أولي خفيف.
تم قطع الدماغ إلى أنصاف وكان نصف الكرة الأرضية واحد آخر ثابتة مع immunofluorescence مخصصة مثبتة، cryoprotectant، شرائح باستخدام cryostat ومعالجتها لدراسات immunofluorescence. حيث تم تثبيت نصف الكرة الآخر مع مثبت المجهر الإلكتروني ، مقطعا إلى شرائح مع الهزاز ومستعدا لدراسات المجهر الإلكتروني. كانت شرائح الدماغ لدراسات المجهر الإلكتروني المسح المستندة إلى كتلة المسلسل على النقيض من ذلك، شقة جزءا لا يتجزأ من الراتنج، ثم تم تركيب منطقة CA1 من قرن آمون إلى دبوس وصورت مع المجهر الإلكتروني المسح القائم على كتلة المسلسل.
وظهر الجزء من البروتوكول الذي تم تسليط الضوء عليه في صندوق أصفر في الفيديو. خذ الأنسجة، التي تم إصلاحها وقطعها إلى 100 شريحة ميكروبيوتيك وغسلها بحاجز الفوسفات البارد خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها. إعداد خليط واحد إلى واحد من 4٪ من التيتروكسيد أوسميوم و 3٪ فيروكسيانايد البوتاسيوم.
المنتج النهائي سوف تتحول البني. تزج العينات في هذا الخليط. ثم ضع العينات على الجليد.
ومن هذه المرحلة فصاعدا من المهم حمايتهم من الضوء. احتضانهم مع اهتزاز لطيف لمدة ساعة واحدة. وفي الوقت نفسه، إعداد حل TCH.
مزيج 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج و 0.1 غرام من TCH. وضعه في فرن تعيين في 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. من المهم أن يسوف الحل من وقت لآخر.
عندما تكون جاهزة، تبريده إلى درجة حرارة الغرفة. الآن غسل العينات مع الماء المقطر مزدوجة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منهما ومن ثم تزج بها في محلول TCH المصفاة. الشرائح ستتحول إلى اللون الأسود.
احتضنهم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل العينات مع الماء المقطر مزدوجة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منهما واحتضانها مع 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم لمدة 30 دقيقة، وهذه المرة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى، وغسل العينات مع الماء المقطر مزدوجة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منهما ووضعها في تصفية 1٪ أو خلات أميل.
احتضنهم عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تبدأ مع إعداد D-الأسبارتات. مزيج نترات الرصاص مع محلول حمض الأسبارتيك مسبقا إلى 60 درجة مئوية.
ضع الخليط في حمام مائي عند 60 درجة مئوية وضبط درجة الحموضة إلى 5.5 مع هيدروكسيد صوديوم مولار واحد. أغلق القارورة مع أسبارتات الرصاص واتركه في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وينبغي أن يكون الحل واضحا.
إذا كان يتحول غائما يجب التخلص منه ويحتاج إلى إعداد واحد جديد. في غضون ذلك، اغسل العينات بالماء المقطر المزدوج الغازي خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها وابقها في الفرن عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تزج العينات في محلول الأسبارتات الرصاص الطازجة واحتضانها في الفرن تعيين في 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
إعداد راتنج الايبوكسي. وزن المكونات وخلط الراتنج جيدا لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل إضافة مسرع DMP 30. إعداد الفيروس مع تخفيف متدرج من الإيثانول.
ثم أخرج العينات من الفرن واغسلها مرة أخرى بالماء المقطر المزدوج خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها. في غضون ذلك، خلط الراتنج مع الإيثانول 100٪ في نسبة واحد إلى واحد للحصول على الراتنج 50٪. امزجها جيدا.
بعد ذلك ، يجفف العينات في كل تخفيف للإيثانول لمدة خمس دقائق. تذكر العينات يجب أن لا تجف تماما. التسلل العينات الأولى في 50٪ الراتنج لمدة 30 دقيقة، المقبل في الراتنج 100٪لمدة ساعة واحدة، ومن ثم مرة أخرى في الراتنج الطازجة 100٪بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، ضع العينات في راتنج طازج بنسبة 100٪ لمدة ساعة واحدة ثم قم بتضمينها بين أوراق تضمين الفلوروبوليمر. إعداد قطع من ورقة التضمين التي تم دي مدهون مع الإيثانول ووضع جانبا الشرائح الزجاجية التي سيتم استخدامها كدعم. وضع قطعة من ورقة تضمين على شريحة زجاجية، ووضع قطرة من الراتنج على ذلك، ثم نقل العينة بعناية مع استخدام عصا خشبية.
تغطية ذلك مع القطعة الثانية. في محاولة لتجنب فقاعات الهواء. كن لطيفا لأن الأنسجة هشة جدا.
ضع بعناية شريحة زجاجية أخرى فوق قطعة الورقة المضمنة وعالج العينة في الفرن عند 70 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل. فصل الطبقات وقطع قطعة من العينة المضمنة مع شفرة حلاقة. نقلها إلى البارافين.
وهذا يقلل من خطر فقدان العينة بسبب الكهروستاتيكيات. خذ دبوس الألومنيوم الذي تم إزالة الشحوم مع الإيثانول. مزيج الايبوكسي موصل جيدا واستخدام كمية صغيرة منه لتركيب العينة إلى دبوس.
علاج الايبوكسي موصل في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تقليم كل جانب من كتلة العينة مع سكين الماس ومن ثم تلميع وجه الكتلة حتى يتعرض النسيج. الأرض العينة إلى دبوس باستخدام الطلاء موصل وعلاجه.
لتقليل الشحن، يجب أيضا رصد العينات المغلفة بطبقة رقيقة من الذهب أو البلاديوم الذهبي. ضع الدبوس مع العينة في غرفة المجهر الإلكتروني المسح المتسلسل القائم على كتلة. محاذاة العينة إلى السكين ومن ثم إغلاق الغرفة وتعيين المعلمات.
جمع كومة من الصور. باستخدام الطريقة الموصوفة ، تم الحصول على صور لأنسجة دماغ الماوس. تم التقاط صورة كبيرة من قرن آمون منطقة واحدة وتم تعيين التصوير في وسط stratum radiatum.
تم الحصول على كومة من الصور وتم تقسيم الأشياء ذات الاهتمام ، مثل العمود الفقري المتشجر ونقاط الاشتباك العصبي. تم الحصول على مورفولوجيا الأنسجة ذات نوعية جيدة مع الأغشية المرئية بوضوح والحوافش متشابك والميتوكوندريا المحفوظة بشكل جيد. أكدت الدراسات المناعية للأجسام المضادة PSD 95 أن التثبيت الأولي المعتدل والتثبيت التقليدي مع 4٪ PFA يعطي نتائج مماثلة.
بروتوكول قدم يتيح الحصول على صور أنسجة الدماغ مع استخدام المجهر الإلكتروني المسح القائم على كتلة المسلسل، مورفولوجيا الأنسجة عالية الجودة، و 12 الأغشية المرئية تسهيل 10 تجزئة الحق وإعادة الإعمار. تثبيت بلدي الأولية جعلت من الممكن استخدام نفس العقول لتحليل PSD 95 immunofluorescence والتصوير المجهري الإلكتروني العمود الفقري dendritic. هنا نستخدم PSE 9، 500 في مهدها.
ومع ذلك، يمكن استخدام الآخر أيضا.
