الهدف العام لهذا البروتوكول هو تحليل الجوانب الرئيسية الهامة لوظيفة E3 ligase ، بما في ذلك خصوصية إنزيم E2 ، واختيار الركيزة ونقل كل مكان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قابليتها للتطبيق على نطاق واسع ، حيث يمكن التعبير عن البروتينات من جميع المصادر eukaryotic بشكل مضمون ودراستها في المختبر دون الحاجة إلى معدات خاصة. عند استخدام تقنية إفراز الليسين لأول مرة، من المهم تحسين معلمات المقايسة، مثل تركيزات الإنزيم، لتحديد ظروف التصريف المثالية للليغاز E3 المفضل.
لإجراء اختبار في المختبر لصناعة السيارات في كل مكان، وإعداد مخطط pipetting لاختبار القدرة الوظيفية لمختلف الإنزيمات E2 وإعداد مزيج رئيسي على الجليد لجميع ردود الفعل في كل مكان بالإضافة إلى رد فعل إضافي واحد. بعد ذلك ، أضف ميكرومولار واحد من إنزيمات E2 إلى الأنابيب المناسبة ، واحتضان العينات في دورة حرارية PCR لمدة ساعتين في ظل الظروف المشار إليها. بعد الحضانة، إضافة المخزن المؤقت عينة SDS إلى كل رد فعل ومزيج عن طريق pipetting عدة مرات.
ثم يغلي على الفور العينات في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق وتخزين البروتينات المشوهة في 20 درجة مئوية. لإجراء اختبار الركيزة في المختبر في كل مكان ، قم بإعداد مخطط الأنابيب لجميع ردود الفعل. بعد حساب كمية المزيج الرئيسي المطلوب لرد فعل واحد، قم بإعداد المزيج الرئيسي لجميع ردود الفعل على الجليد وإضافة المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب.
إضافة كل من الليجا E3 بشكل فردي. ثم احتضان العينات في دورة PCR الحرارية لمدة ساعتين كما هو موضح. في نهاية الحضانة، إضافة مرتين SDS عينة العازلة لكل رد فعل، مزيج عدة مرات عن طريق pipetting، وغلي العينات لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية.
لإجراء فحص تفريغ الليسين ، قم بإعداد مخطط الأنابيب لرد فعل الشحن واحتضان ردود فعل الشحن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لإيقاف رد فعل الشحن، أضف apyrase إلى تركيز نهائي قدره 1.8 وحدة لكل ملليلتر واحتضان التفاعل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، أضف EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 30 ملليمولار واستخدم الماء المقطر المزدوج لضبط حجم التفاعل إلى 30 ميكرولتر.
لتفريغ E2 في كل مكان بواسطة E3 ، قم بإعداد خمسة أنابيب مطابقة للنقاط الزمنية للتجربة ، وإضافة 6.7 ميكرولتر من مخزن العينة المؤقت غير المخفض إلى كل أنبوب ، وإزالة ستة ميكرولترات من رد فعل الشحن المتوقفة من أنبوب نقطة الصفر الزمنية ، وضبط الحجم الإجمالي إلى 26.7 ميكرولتر. لإعداد ردود الفعل التفريغ، إضافة المياه المقطرة المزدوجة، عازلة في كل مكان، BSA، ليسين، E3 ligase وE2 اتهم لكل رد فعل. بعد الفترات الزمنية المحددة، نقل عينات 20 ميكرولتر من كل رد فعل التفريغ إلى أنبوب العينة المقابلة.
ثم دوامة على الفور العينات، ووضعها في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في هذا التحليل التمثيلي الغربي، لم يكن CHIP غير النشط في كل مكان. ومع ذلك ، تم تشكيل منتجات UBIquitin المستقلة E3 في وجود CHIP غير نشط وفي غياب CHIP.
تم نقل رقاقة البرية من النوع التلقائي في كل مكان عندما جنبا إلى جنب مع بروتينات UBE2D والأسر UBE2E، في حين تم إنتاج سلاسل البوليبيكيتين مجانا بالتعاون مع بروتينات الأسرة UBE2D ولكن ليس مع بروتينات الأسرة UBE2E. توجيه الربط من ubiquitin بواسطة UBE2N/V1 تشكيل سلاسل ubiquitin الحرة. ولوحظ أن الانتشار التلقائي للمركبات من طراز UNC-45B وانتشارها في كل مكان باستخدام رقاقة من النوع البري ولكن ليس مع المتحول غير النشط ل CHIP، مما يشير إلى أن UNC-45B يعمل كركيزة محفوظة ل CHIP.
عندما تم تحليل النشاط الحفاز ل CHIP باستخدام فحص إفرازات اللسين ، كان وزن إنزيم UBE2D2 غير المشحون 17 كيلودالتون ، وكان وزن UBE2D2 المشحون مع جزيء واحد في كل مكان وزنا جزيئيا يبلغ حوالي 26 كيلودالطن. في الوقت 0، لوحظ العائد E2 مشحونة بالكامل. في وجود رقاقة غير نشطة ، تم الكشف عن تفريغ E3 المستقلة E3 باهتة من UBE2D2 ولكن ليس لصناعة السيارات في كل مكان من CHIP.
في وجود نوع البرية CHIP، كان تفريغ UBE2D2 سريع والانتهاء في غضون 60 دقيقة، والسيارات في كل مكان من CHIP أشار إلى نقل كل مكان على بقايا ال ليسين الخاصة بها. نظرا لقدرة E2 المحدودة ، اعمل في أسرع وقت ممكن ، ثم تابع على الفور رد فعل التفريغ متبوعا ب SDS-PAGE والنشاف الغربي. بعد بروتوكولات التكتيل في المختبر هذه ، يمكن تحديد أنواع الربط المحددة في كل مكان من خلال فحص البقع الغربية بالأجسام المضادة الخاصة بالروابط.
