يسمح هذا البروتوكول بمراقبة وظائف خلايا الذوق في البيئة الطبيعية الدقيقة مع الاتصالات العصبية والدورة الدموية المتبقية سليمة. باستخدام هذه التقنية، يمكن التحقيق في الاتصالات من خلية إلى خلية في الجسم الحي. للبدء، وملء خزانات نظام تدفق الضغط مع اللعاب الاصطناعي وastastants.
قم بتوصيل خط الهواء المضغوط بمدخلات المنظم وحدد ضغط الهواء في نظام التسليم السائل إلى 30 إلى 50 رطلا لكل بوصة مربعة. تعيين ضغط الناتج من المنظم إلى 0.4 جنيه لكل بوصة مربعة والتحقق مما إذا كان السائل يبدأ تتدفق من الأنبوب. ربط متعددة من الخزانات إلى منفذ الإدخال من اللسان الصغير، ثم ربط منفذ الإخراج من اللسان الصغير إلى مضخة حقنة وسحب السائل في حوالي 300 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لتأسيس حالة ثابتة.
تأكد من أن حجم القطيرات المعلقة تحت اللسان الصغير لا يزال ثابتا وضبط ضغط الهواء ومعدل التدفق للحصول على ارتفاع العينة المطلوب. بمجرد إعداد نظام microfluidic ، افصل خط الهواء المضغوط واطفئ مضخة الحقنة حتى يتم إعداد الماوس للتصوير في الجسم الحي. بعد إعطاء التخدير إلى الماوس، حقن عن طريق الوريد TRITC-dextran من خلال مسار مداري الرجعية لمراقبة الدورة الدموية أثناء التصوير.
مع وضع الماوس في وضع السبق، رش 70٪ الإيثانول على رأسه. استخدم ملقط لرفع جلد الرأس بخفة، ثم استخدم مقصا لقص ما يقرب من سبعة ملليمترات مربعة من الجلد. بعد تنظيف الشعر حول فروة الرأس، قم بإزالة الغشاء المحيطي من تحت الجلد وتطبيق لاصق فوري على الجمجمة.
ثم إرفاق المثبت الرأس مخصصة. بمجرد تصلب اللاصق الفوري ، ضع غراء الأسنان حول مثبت الرأس وترسيخه عن طريق الإضاءة مع الضوء الأزرق. باستخدام لاصقة فورية للصق الشفة السفلى من الماوس إلى الوحدة السفلية من اللسان الصغير، ثم وضع الماوس على لوحة إعداد الماوس وتأمين وحدة أسفل في اللسان الصغير إلى وظائف عقد عن طريق محاذاة الثقوب على حافة اللسان الصغير مع المشاركات.
قم بشد مثبت رأس الماوس إلى حامل مثبت الرأس في اللوحة وضبط المسافة بين رأس الماوس والجهاز. ثم باستخدام حامل مثبت الرأس، قم بتدوير رأس الماوس بسلاسة بمقدار 45 درجة تقريبا. بعد تأمين الماوس إلى المجلس، استخدم ملاقط بلاستيكية لرسم لسانه بلطف.
ثم باستخدام لاصقة فورية، نعلق الجانب البطني من اللسان إلى الجانب العلوي من الوحدة السفلية من اللسان الصغير. للحفاظ على رطوبة اللسان، امسح السطح بمسحة قطنية مبللة، ثم ضع قطعة من الأنسجة غارقة في اللعاب الاصطناعي على سطح اللسان المكشوف. ضع الغسالات المنحنية على المشاركات ، مع الاحتفاظ بالجزء السفلي من اللسان الصغير ، ثم نقل إعداد الماوس إلى مرحلة المجهر.
ضع اللسان المكشوف للفأرة تحت المركز التقريبي لمنطقة الهدف المجهر ، مع التأكد من عدم الانحراف عن النطاق الديناميكي للمرحلة ، ثم شد البراغي لإرفاق لوحة الماوس بقوة على المسرح. ضع وسادة تسخين تحت الماوس للحفاظ على درجة حرارة جسمها بين 36.5 و 37.5 درجة مئوية. لمنع السائل من دخول القصبة الهوائية الماوس، وضع قطعة رقيقة من الورق الملتوية داخل فم الماوس، ثم إزالة الأنسجة الرطبة وضعت على سطح اللسان ووضع اللسان الدقيقة المعدة على لسان الماوس، بحيث سطح اللسان مرئيا من خلال نافذة التصوير.
تأمين اللسان الصغير عن طريق الشد بلطف كلا طرفي مع الحد الأدنى من الضغط الضغط. للبدء في الحصول على الصور، افتح برنامج المجهر، ثم قم بتشغيل ليزر 920 نانومتر ثنائي الفوتون. جبل الهدف الغمر المياه على المجهر، ثم خفض الهدف على نافذة التصوير من اللسان الصغير وتزج الهدف.
في وضع الكاميرا، يضيء سطح اللسان عن طريق تشغيل الضوء الأزرق من مصباح الزئبق. للعثور على المستوى البؤري التقريبي، قم بضبط المحور Z وابحث عن إشارة الفلورة التلقائية من الحليمة الخيطية. ثم باستخدام مقبض تعديل X و Y ، حدد موقع برعم الذوق.
قم بالتبديل إلى وضع الفوتون المتعدد، ثم قم بتعيين الطول الموجي للإثارة، ومجموعة فلتر الانبعاثات، ووضع المسح الضوئي، وحجم الإطار للحصول على الصورة. مع برعم الذوق في مركز نافذة التصوير ، حدد موقع الأوعية الدموية المحيطة برعم الذوق في حوالي ثلثي ارتفاع برعم الذوق وتصور الدورة الدموية. إذا كان تدفق الدم مسدودا، فاخفف قليلا من مسامير التثبيت لاستئناف تدفق الدم.
ضبط Z-محور للعثور على الطائرة Z من برعم الذوق تحتوي على عدد كاف من خلايا الذوق، ثم المضي قدما في تصوير الكالسيوم في 2-6 هيرتز لمدة 80 ثانية. بعد بدء التصوير، قم بتشغيل خزان النظام السائل لتوفير محلول للذوق لمدة 20 ثانية. بعد 20 ثانية من تحفيز الذوق، قم بتبديل الخزان مرة أخرى إلى اللعاب الاصطناعي.
أثناء التصوير، انتظر لمدة ثلاث إلى أربع دقائق بين الجلسات التي توفر باستمرار اللعاب الاصطناعي للحفاظ على رطوبة اللسان وغسل التيستانت المتبقي من الجلسة السابقة. سطح اللسان من بيرت-GCaMP6f-tdTomato الماوس مغطى الحليمات الخيطية الموائعة وبراعم الذوق تنتشر بشكل متفرق. يتم التقاط الحليمة الخيطية باللون الأصفر باستخدام كاشف صور يتراوح بين 500 و550 نانومتر ويمكن ملاحظته من سطح اللسان حتى عمق 25 ميكرومتر تقريبا.
تمثل إشارات GCaMP باللون الأخضر التي تم اكتشافها بواسطة فلتر 500 إلى 550 نانومتر وإشارات tdTomato باللون الأحمر ، التي اكتشفها مرشح 607 إلى 670 نانومتر ، خلايا الذوق. يتم الحصول على إشارة tdTomato لتحليل مقياس النسبة. يتم الحصول على الأوعية الدموية التي تحيط برعم الذوق باستخدام مرشح 500 إلى 550 نانومتر المحدد في النسيج الضام الكولاجين ، والذي يدعم هيكليا برعم الذوق ، يتم الحصول عليها باستخدام مجموعة مرشح 447 إلى 460 نانومتر.
في هذا المثال التمثيلي لفحص الذوق في الجسم الحي باستخدام تصوير الكالسيوم ، يتم ترسيم كل خلية ذوق بواسطة خطوط متقطعة. في هذه التجربة، استجابت الخلية 2 لكل من التواسات الحلوة والأومامي. واستجابت الخلية 3 لكل من التيسات الملح المنخفضة والعالية.
لم تستجب أي من الخلايا في برعم الذوق هذا للأذواق الحامضة. وبما أن الغرض من هذه التجربة هو مراقبة وظيفة الخلايا المذاق في البيئة الطبيعية ، فمن المهم تسليم الفلورسنت إلى الأوعية الدموية في خطوة التحضير وتأكيد الدورة الدموية أثناء التجربة.
