إن أخذ بصمات الحمض النووي هو أداة شائعة في العلوم البيولوجية وتطبيقها في اختبار الأبوة، وكذلك الدراسات الجنائية أو الوراثية. تم تصميم هذا البروتوكول لتزويد الطلاب الجامعيين بالمبادئ الأساسية لأخذ بصمات الحمض النووي في الفصول المختبرية. وهو يستند إلى الموضع D1S80 الإنسان، وهو عدد متغير من منطقة يكرر جنبا إلى جنب، والتي أليليس يمكن أن تختلف في الطول بين الأفراد.
استخراج الحمض النووي، PCR، هلام الكهربائي، والتحليل اللاحق يمكن أن تكون صعبة لأداء، وخاصة إذا فعلت للمرة الأولى. العرض المرئي لجميع الخطوات يسمح للمشاهدين لمراقبة الممارسة العامة، والتفاصيل، والاحتياطات التي يجب اتخاذها أثناء تنفيذ هذا البروتوكول قوية جدا. لاستخراج الحمض النووي من الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي، تبدأ بحصاد الخلايا باستخدام مسحة فموية معقمة.
استخدم مسحة لفرك بقوة على داخل الخد لمدة 30 إلى 40 ثانية. ضع طرف مسحة المجموعة في أنبوب الطرد المركزي الصغير المعقم المسمى واقطع طول البلاستيك الذي يمتد إلى ما وراء الحافة، وإغلاق الأنبوب. سخني كتلة التدفئة إلى 65 درجة مئوية واستعدي جميع المخازن المؤقتة والحلول المطلوبة.
أضف 500 ميكرولتر من محلول الليس إلى المسحة ، مع التأكد من أن العينة مغمورة تماما في محلول الليس ودوامة العينة لمدة خمس ثوان على الأقل. احتضان العينة لمدة 10 دقائق في 65 درجة مئوية ودوامة في بعض الأحيان. بعد الحضانة، قم بإزالة المسحة بالضغط عليها على جدار الأنبوب للحصول على حجم عينة قصوى.
إضافة 100 ميكرولتر التشبع العازلة إلى خلايا الليس ومزيج تماما عن طريق عكس الأنبوب حتى يعجل الأبيض يصبح مرئيا. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق في 17، 950 G.Transfer 450 ميكرولتر من supernatant في نظيفة، 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي الصغير. ثم إضافة 450 ميكرولتر من ايزو 2-بروبانول وتخلط جيدا عن طريق عكس أنبوب لتسريع الحمض النووي.
احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وعكس الأنبوب على منشفة ورقية نظيفة وتجفيف بيليه. غسل الحمض النووي مع 500 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول، والطرد المركزي قريبا لمدة دقيقة واحدة، والتخلص من supernatant.
لتجفيف بيليه تماما، واحتضان العينة لمدة خمس دقائق في 65 درجة مئوية في كتلة التدفئة. وأخيرا، إضافة 30 ميكرولتر من العازلة elution واحتضان لمدة 10 دقائق في 65 درجة مئوية لعطل سيز الحمض النووي. إعداد المزيج الرئيسي عن طريق إضافة العازلة PCR الخضراء، DNTPs، التمهيديات، والمياه، والبوليميراز إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة.
تسمية أنابيب PCR مع أرقام العينة وaliquot 45 ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي لكل أنبوب PCR. بعد ذلك، أضف خمسة ميكرولترات DNA، أو، للتحكم بدون قالب، أضف الماء. أغلق أنابيب PCR واطردها لفترة وجيزة.
ضع الأنابيب في دورة الحرارية وبدء برنامج PCR. عند اكتمال البرنامج، قم بتخزين العينات عند أربع درجات مئوية حتى يتم إجراء المزيد من المعالجة. إعداد هلام agarose 1.5٪ عن طريق وزنها 1 1/2 غرام من مسحوق الآغاروز وخلطه مع 100 ملليلتر من محلول TAE العازلة في زجاجة.
سخني خليط الآغروز بعناية في ميكروويف ودوامة الخليط بينهما حتى يذوب الآغروز تماما. كن على علم بأن التأخير في الغليان قد يحدث. بعد تبريد قصير من خليط الآجروز، إضافة اثنين من microliters من الأخضر بيتش.
صب هلام واستخدام مشط مع ما يكفي من الآبار للعينات. بعد البلمرة الكاملة لهلام الآغروز، قم بتحميل الآبار ب 10 ميكرولتر من كل عينة من عينات PCR وأضف معيار الوزن الجزيئي إلى الآبار المحيطة. تشغيل هلام في 150 فولت لمدة 40 دقيقة تقريبا.
لتصور منتجات PCR ، قم بتصوير الجل باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. لتحليل الأليل D1S80 مكبرة، ضع مسطرة بجانب معيار الوزن الجزيئي بدءا من الآبار على صورة هلام الصورة. قياس المسافة لكل نطاق من مقياس الوزن وتسجيل أطوال في جدول حساب البرنامج.
بعد ذلك، حدد لوغاريتم كل حجم جزء من مقياس الوزن. أدخل مؤامرة مبعثرة باستخدام أحجام الأجزاء القياسية للوزن التي تم تحويلها إلى سجل، والمسافات المقاسة من الجل. احتواء خط اتجاه وعرض معادلة الانحدار وقيمة R-مربع.
في جدول جديد، أدخل القياسات المسافات من amplicons PCR إلى الآبار. لتحديد حجم هذه amplicons استخدم معادلة الانحدار من الانحدار الخطي وحساب antilog للحصول على أحجام الأجزاء في أزواج أساسية من amplicons. وأخيرا تعيين وحدات تكرار 16 أزواج قاعدة لكل amplicon قياس.
كان استخراج الحمض النووي وتضخيم موقع D1S80 ناجحا لجميع الأفراد الذين تمت دراستهم ، ولم يظهر التحكم في عدم وجود قالب في الممر 10 أي أمبليكونات. من تحليل طول الجزء ، تم تصنيف الأفراد في كونهم متجانسين أو heterozygous مع اثنين من الأليل. وكان عدد الوحدات المتكررة لتكرار الترادف قابلا للربط بوضوح، ويمكن أن يخدم الآن لإجراء مزيد من التحليل.
هنا نحن وصف طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتنفيذ بصمات الجزيئية في الفصول الدراسية العملية الجامعية. يمكن إكمال الإجراء بأكمله في غضون يوم عمل واحد، ويتألف من أربع خطوات مختلفة. في الخطوة الأولى، يتم إعداد قالب الحمض النووي.
يتم حصاد الخلايا الظهارية البوغة عن طريق أخذ عينات من المسحة. مسحات عن طريق الفم هي أداة موثوقة لتوفير كمية ونوعية كافية من الخلايا لاستخراج الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول استخراج الحمض النووي لا يستخدم المذيبات العضوية، وهو أمر مفيد في الفصول المختبرية الجامعية.
يمكن الانتهاء من الخطوة الأولى في غضون 90 دقيقة أو أقل. في الخطوة الثانية، يتم تضخيم الموضع D1S80 بواسطة PCR. شروط PCR المعروضة هنا قوية حتى في حالة سوء نوعية قالب الحمض النووي.
يمكن إكمال هذه الخطوة في 2 1/2 ساعة. ثم يتم تحليل منتجات PCR بواسطة إلكتروفورسيس هلام الآغاروز. Agarose هلام الكهربائي له العديد من المزايا مقارنة مع تقنيات أخرى، مثل تجنب المكونات الخطرة وتقنية إعداد بسيطة.
يمكن الانتهاء من هذا التحليل في 90 دقيقة. بعد التحليل الكهربائي، يمكن تحليل نتائج طول الجزء في غضون 90 دقيقة عن طريق تحليل الانحدار الخطي، إما باستخدام برنامج حساب الجدول، أو باستخدام آلة حاسبة بسيطة. وباختصار، يمكن استخدام طريقة أخذ البصمات المعروضة في العمليات العملية العملية لتعليم استخدام العلامات الجزيئية وتطبيقها في العلوم البيولوجية.
