كما يظهر بروتوكولنا ، يمكن استخدام تقنيات CRISPR CasRx لتحقيق تخفيضات في كل مكان وأنسجة محددة في نص الجينات في ذباب الفاكهة. تقدم تقنيتنا حزمة بداية لأي شخص مهتم باستخدام تخفيض نسخة الجينات المستندة إلى CRISPR في ذباب الفاكهة مع التوافق مع المزيد من التخصيص والتحسين. لإعداد في كل مكان في الجسم الحي الجيش الملكي النيبالي استهداف باستخدام نظام CasRx مكون اثنين، وجمع 10 الذباب الإناث البالغة العذراء من خط gRNA homozygous من الفائدة وخمسة الذباب الذكور البالغين من متوازن heterozygous يوبيك CasRx CurlyO.
ضع الذباب الأبوي في قارورة مكملة ب 100 ميكروغرام من مسحوق الخميرة الجافة وخلفية القنينات لمدة 48 ساعة عند 26 درجة مئوية. مراقبة قنينات كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذرية الكبار جديدة قد ظهرت من العانة من جيل F1 وتخدير أي من البالغين مع ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 ثانية. بمجرد أن يصبح الذباب غير متحرك فارغة القارورة على لوحة ذبابة متصلة بخزان ثاني أكسيد الكربون مع ثاني أكسيد الكربون المستمر واستخدام كاميرا ملونة متصلة مجهر ستيريو الفلورسنت لتسجيل وصورة الأنماط الظاهرية للذباب.
ثم عد أعداد ذرية مع الأنماط الظاهرية المختلفة، وفقا للتعبير إشارة الفلورسنت. استنادا إلى علم الوراثة المندلي، من المتوقع أن يعبر 50٪ من السلف عن الحمض النووي الريبي المستهدف. لاحظ أن سمية نظام Ubiq CasRx قد تقلل من نسبة الحمض النووي الريبي المستهدف الذي يعبر عن ذرية إلى أقل من 50٪ لإعداد في كل مكان في استهداف الحمض النووي الريبي الخارجي في الجسم الحي باستخدام نظام CasRx مكون من ثلاثة مكونات ، وجمع ثمانية إلى 10 ذباب أنثى بالغة عذراء من خط تعبير مزدوج من لوسيفراز وأربعة إلى خمسة ذباب ذكور بالغين من heterozygous Ubiq CasRx Curly بالإضافة إلى TM6 ، STB الخط الذي يعرض عيون بيضاء، أجنحة مجعد، وDS مضان أحمر في وقت واحد.
وضع الخطوة الأبوية واحدة عبر من قبل في قارورة تكملها 100 ميكروغرام من مسحوق الخميرة الجافة والخلفية هذا الصليب لمدة 48 ساعة في 26 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، قم بإزالة جميع الذباب الأبوي من كل قارورة وأعيد القنينات إلى حاضنة 26 درجة مئوية لمدة 14 يوما على الأقل. على مدى 14 يوما، كما ذكر سابقا جمع ثماني إلى 10 العذارى الإناث من اليراع اليراعات المثلية لوسيفيراز التي تستهدف خط الجيش الملكي النيبالي ثلاث مرات.
مراقبة خطوة واحدة عبر قوارير كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذريات الكبار جديدة قد ظهرت من الخوخ، تخدير مع ثاني أكسيد الكربون للسماح لجمع من أربعة إلى خمسة الذباب الذكور التعبير عن كل من يوبيك CasRx ومراسل لوسيفراز المزدوج كما هو متاح. وضع الذباب في قارورة جديدة مع 10 الإناث العذراء من ذبابة الفاكهة luciferase استهداف خط gRNA، ووضع هذه الخطوة اثنين الصلبان في 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. جمع آخر خمسة يوم واحد من الذكور الذين يعبرون عن كل من Ubiq CasRx ومراسل لوسيفراز مزدوجة من قنينات الصليب خطوة واحدة واحتضان الذباب لمدة يومين إلى أربعة أيام وحدها في 26 درجة مئوية قبل نقلها إلى جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر لتخزين ناقص 80 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، قم بإزالة جميع قوارير الوالدين من كل قنينة من قنينات الصليب الخطوة الثانية. وإرجاع القنينات إلى حاضنة 26 درجة مئوية لمدة 20 يوما على الأقل. مراقبة الخطوة اثنين من قوارير الصليب كل يوم لمعرفة ما إذا كان أي ذرية الكبار جديدة قد ظهرت من العانة، تخدير الذباب مع ثاني أكسيد الكربون لأنها تصبح متاحة، وتسجيل وتصوير الأنماط الظاهرية الخاصة بهم كما هو موضح.
تشير الوراثة المندلية إلى أنه إذا كانت جميع الذباب قابلة للحياة ، فيجب على 25٪ من السلف التعبير عن الحمض النووي الريبي المستهدف. لإجراء فحص لوسيفيراز، قم بتوليد ذباب الهتروزيغوس الثلاثي وكذلك ذباب التحكم كما هو موضح. جمع الذباب الذكور عند الولادة، والشيخوخة لهم حتى ثلاثة أيام من العمر.
نقل الذباب البالغ من العمر ثلاثة أيام إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر، وتحلل لهم باستخدام عازلة في العازلة تحلل لوسيفيراز من عدة المقايسة لوسيفيراز المتاحة تجاريا. ثم استخدم خمسة ميكرولترات من الأنسجة المفروصة من كل عينة ومقياس الإنارة لقياس كل من ذباب الفاكهة وركض نشاط لوسيفيراز ، وفقا لبروتوكولات فحص لوسيفراز القياسية. F1، عبر heterozygous CasRx، لديها معدلات بقاء أقل بكثير بالمقارنة مع الذباب عبر heterozygous dCasRx.
وتأكيدا لسمية نظام يوبيك كاسرإكس للجينات الثلاث المستهدفة، فإن ذباب U6 gRNA Y heterozygous غير قابل للحياة ولا ينمو إلى ما بعد المرحلة الثانية من يرقات النجوم. على قيد الحياة Ubq CasRx وU6 gRNA W heterozygous الذباب، وإظهار متميزة البنتانت تماما نمط الظاهري واسعة العينين. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ أيضا انخفاض كبير في النصوص الجينية المستهدفة لثلاث جينات مستهدفة.
ويلاحظ أيضا دليل على النشاط خارج الهدف الناجم عن CasRx عند مقارنة النصوص التفاضلية المعبر عنها بين عينات من CasRx تعبر عن الذباب وعينات من dCasRx تعبر عن الذباب. في تقاطع الخطوتين ، يؤدي فقط الجمع بين جميع الجينات الثلاثة العابرة إلى فتك بنسبة 100٪. عندما يتم استخدام الأنسجة محددة RNA استهداف باستخدام ثلاثة مكونات تصميم نظام CasRx، يتم تقليل مستوى السمية عندما يتم خفض التعبير CasRx الشاملة باستخدام المروج UAST بالمقارنة مع أن من المروج يوبيك.
من المهم إعداد العملية الوراثية بشكل صحيح باستخدام الذباب من النوع الصحيح والأنماط الظاهرية الصحيحة.
