سيساعد بروتوكولنا الباحثين على فهم الآثار الفسيولوجية لثلاث طرق مختلفة لزراعة نخاع العظم وكيف تؤثر على النتائج التجريبية في إعداد الهيماتوبويز الكلوي. يمكن أن يؤثر إجمالي زرع نخاع العظم الإشعاعي للجسم سلبا على أعضاء القلب والأوعية الدموية ويغير مسببات الأمراض. وهكذا، طور مختبرنا طريقتين بديلتين لتقليل أو تجنب الآثار الجانبية المحتملة.
إظهار الإجراءات سيكون Eunbee بارك طالب دراسات عليا، وميغان ايفانز زميل ما بعد الدكتوراه، سواء من مختبري لحماية الصدر والبطن، ووضع صينية قابل للتعديل والأشعة السينية المشععة على المسافة الصحيحة لتحقيق التشعيع موحدة. ووضع الفئران المخدرة على لوحة مسطحة بقيادة مقلوبة لبعضها البعض في موقف supine. تأمين الكفوف إلى لوحة مع الشريط، ووضع التدريع بقيادة بحيث الطرف السفلي محاذاة مع عظم xiphisternum والطرف العلوي من الدرع الرصاص يجلس بالقرب من الغدة الصعترية.
بعد التدريع ، ضع الفئران في المشعع وعرض الحيوانات إلى جزئين أو 5.5 أجزاء رمادية من الإشعاع تفصل بينهما فاصل زمني من أربع إلى 24 ساعة. لدرع الرأس، الشريط بعناية الكفوف الأربعة من الماوس إلى البطن. ضع الماوس في مقيد مخروطي وحرك المقيد في الفتحة داخل الدرع الرصاص بحيث يتم تغطية رأس الفأر وأذنيه بالكامل ، مما يترك بقية جسم الماوس عرضة للإشعاع.
بعد التدريع وضع الفئران في المشع ويعرض الحيوانات ل، إلى 5.5 كسور رمادية من الإشعاع مفصولة بفاصل زمني من أربع إلى 24 ساعة. بعد كل علاج إشعاعي ، ضع الفئران المخدرة في قفص على حصيرة ساخنة مع المراقبة حتى تتعافى تماما. لعزل العظام، وتطهير الجلد من الماوس المانحة مع الإيثانول 70٪، وجعل شق الجلد عرضية صغيرة تحت القفص الصدري.
عقد الجلد بإحكام على جانبي الشق، المسيل للدموع في اتجاهين متعاكسين نحو الرأس والقدمين وقشر الجلد من جميع الأطراف. قطع على الكتفين ومفاصل الكوع، واستخدام مسح مختبر لإزالة العضلات المرفقة والأنسجة الضامة من humeri. قم بخلع المفاصل بعناية بين عظم الفخذ وعظام الورك.
واستخدام مقص حاد لقطع على طول رؤساء الفخذ لفصل الساقين. قطع على مفصل الركبة، لفصل عظم الفخذ والساق. واستخدام مناديل المختبر لإزالة بعناية العضلات المرفقة والأنسجة الضامة من العظام.
ثم سحب العظام من الفئران من نفس النمط الجيني في أنابيب مخروطية فردية 50 ملليلتر تحتوي على 20 ملليلتر من الجليد البارد العقيم PBS على الجليد. لعزل خلايا نخاع العظم في خزانة من الدرجة الثانية للسلامة الحيوية، استخدم إبرة قياس 18 لإحداث ثقب صغير في الجزء السفلي من أنبوب صغير معقم 500 ميكرولتر. ووضع الأنبوب في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر صغيرة عقيمة الفردية التي تحتوي على 100 ميكرولتر من الجليد البارد عقيمة PBS.
عندما يتم إعداد جميع الأنابيب، قم بإزالة برنامج تلفزيوني من الأنبوب الذي يحتوي على العظام المعزولة ونقل العظام إلى طبق زراعة الخلية المعقمة 100 ملليمتر. استخدم ملقط ناعم ومقص صغير لإزالة الصرع بعناية من نهايات كل عظمة، ووضع ما يصل إلى ستة عظام في كل أنبوب 500 ميكرولتر. عندما يتم قطع جميع العظام، استخراج خلايا نخاع العظام عن طريق الطرد المركزي.
إذا تمت إزالة جميع محتويات النخاع، يجب أن تظهر العظام بيضاء وشفافة مع بيليه أحمر كبير نسبيا في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 ملليلتر. لزرع خلايا نخاع العظم، تمييع خلايا نخاع العظم المعزولة في وسائط RPMI الخالية من المصل، وتحميل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة الأنسولين 0.5 ملليلتر واحدة لكل فأر ليتم حقنها. بعد تأكيد عدم وجود استجابة لرد الفعل دواسة، حقن ببطء حجم كامل من الخلايا في الوريد المداري الرجعية من كل المتلقي تخدير.
ثم ضع قطرة من البروبراكائين على العين لتخفيف الألم. والسماح للفأر لاستعادة وعيه أثناء رصدها. لمقارنة تأثير ثلاث طرق الشروط المسبقة BMT على الحرمان من خلايا المانحين.
تم تحليل كسور الخلايا المانحة في الدم المحيطي وأنسجة القلب عن طريق قياس التدفق الخلوي في شهر واحد بعد BMT. في هذا التحليل التمثيلي ، في الدم المحيطي للفئران المتلقية التي تلقت إشعاع الجسم الكلي ، تم استئصال الخلايا الأحادية والنيوتروفيل والخلايا B إلى حد كبير واستبدالها بذرية الخلايا المشتقة من نخاع العظم المانحة. وبالإضافة إلى ذلك، تم استبدال السكان المقيمين المتلقي monocyte القلب والعدلات تماما تقريبا من قبل الخلايا المشتقة من المانحين.
في مجموعة التشعيع المحمية جزئيا ، كان استبدال الخلايا المناعية القلبية المشتقة من المتبرع متواضعا. من المرجح أن تكون خلايا نخاع العظم الفأر المتلقية داخل المناطق المحمية قد ساهمت في انخفاض مستوى إعادة تشكيل الدم المحيطي مقارنة بالفئران التي تلقت إشعاعا كاملا للجسم. في المجموعة دون شروط مسبقة BMT، كانت الخلايا المشتقة من المانحين يمكن الكشف عنها في الدم المحيطي وقلوب الفئران المتلقية في أربعة أسابيع بعد BMT.
بالإضافة إلى ذلك ، توسعت خلايا Tet2 المانحة الناقصة تدريجيا بمرور الوقت. وبالمقارنة، أظهرت الفئران المتلقية المحتقنة بخلايا مانحة من النوع البري الحد الأدنى من التوسع اللاستنساخي للخلايا المانحة. وسوف الأمثل لهذه النماذج التجريبية تمكين دراسات أكثر صرامة من الجينات سائق الدم الكلوة التي تسهم في جميع تسبب وفيات مثل أمراض القلب والتمثيل الغذائي والسرطان.
نأمل أن تسمح بروتوكولاتنا للباحثين بدراسة حالات الهيماتوبويز اللاستنساخية للتحقيق في كيفية مساهمتها في أمراض القلب والأوعية الدموية وغيرها من حالات الأمراض.
