يسمح بروتوكولنا بالنشر البكتيري وتتبع العبء في نموذج تعفن الدم الوليدي التجريبي في الوقت الحقيقي، والقدرة على ربط علامات المرض الأخرى بعبء الممرض. يسمح لنا هذا البروتوكول بتحليل الإنتان بشكل طولي في فئران حديثي الولادة الفردية، مما يوفر الفرصة لمراقبة ومقارنة ديناميكيات العدوى ونشر البكتيريا في الوقت الحقيقي. يمكن إجراء الاختبار قبل الفحصي للتدخلات الخاصة بتعفن الدم الوليدي باستخدام هذه الطريقة، مما يسمح بمراقبة آثار التحكم في البكتيريا.
تبدأ من خلال وضع الجراء مطابقة العمر في مجموعات القمامة إما عالية أو منخفضة الجرعة داخل مستوى السلامة البيولوجية اثنين من مجلس الوزراء. في اليوم التالي للولادة ثلاثة أو أربعة، تسجيل الأوزان من جميع الجراء قبل التطعيم. تحميل حقن الأنسولين مع برنامج تلفزيوني أو جرعة عالية أو منخفضة E.coli lux inoculum في مجلس الوزراء السلامة الحيوية ووضع الحقن المحملة على الجليد.
وضع الوليد ليتم حقنها على سطح نظيف داخل مجلس الوزراء السلامة الحيوية ورفع الجلد في مؤخر الرقبة كما لو أن scruff الجرو. أدخل الإبرة المشطفة تحت الجلد في المساحة التي تم إنشاؤها بين الجلد والعضلات. عندما يمكن الشعور بالإبرة تحت الجلد ، قم بحقن 50 ميكرولترات من المطعّم بينما تطلق في الوقت نفسه الجزء المقوص من الجلد لمنع التدفق الخلفي ، ثم قم بإزالة الإبرة ببطء وعناية.
عندما تم حقن جميع الجراء بنفس الطريقة ، عودوا الجراء إلى سدودهم. مباشرة بعد الحقن وفي الوقت التجريبي المناسب نقاط بعد ذلك، وضع القفص مع E.coli لوكس إصابة الفئران الوليدية وسد في مستوى السلامة البيولوجية اثنين غطاء محرك التدفق لارينار وفتح البرنامج في الكمبيوتر التصوير المقطعي الجزئي. بعد تهيئة النظام وانتظار درجة حرارة المرحلة لقفل عند 37 درجة مئوية ودرجة حرارة CCD لقفل في السلبية 90 درجة مئوية، ووضع ما يصل إلى أربعة الجراء تخدير على مربع التصوير في غرفة التصوير في موقف عرضة.
أغلق باب غرفة التصوير وحدد خيار تصوير الإضاءة. حدد مرشح فتح وتليها وتعيين مرشح الإثارة لمنع ومرشح الانبعاثات لفتح. حدد 500 و520 و560 و580 و600 و620 نانومتر.
ثم صورة الجراء قبل إعادتها إلى القفص مع السد مع رصد حتى الانتعاش التخدير. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، في خزانة السلامة البيولوجية، غمر الولدان الرحيم بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث ووضع الحيوان على جانبه الأيمن. استخدام ملقط لفهم الجلد بين البطن والقدم اليسرى الخلفية واستخدام مقص دقيق تلميح الجراحية لجعل شق الجلد.
ثم استمر في شق نحو الجزء الخلفي من الحيوان حتى يتعرض الطحال بأكمله. استخدام ملقط ومقص لإزالة الطحال من البطن ووضعها في الحل المناسب لتطبيقها المصب. للحصول على الرئتين ، قشر مرة أخرى جلد الصدر تماما وتدخل في قاعدة القص مع مقص عقد عموديا ، وقطع صعودا حتى يتم تقسيم القفص الصدري.
استخدم ملقطًا لفهم الرئتين اليمنى واليسرى بشكل فردي وإزالة الرئتين من تجويف الصدر. إزالة القلب من أنسجة الرئة مع مقص. ثم ضع الرئة في الحل المناسب لتطبيقها المصب.
لتنفيذ مقايسة قتل بكتيريا في المختبر ، ضع الطحال غير المصاب في مصفاة نايلون 40 ميكرومتر داخل طبق بيتري معقمة 60 ملليمترًا تحتوي على خمسة ملليلترات من PBS تكملها مصل بوفين الجنين بنسبة 10٪واستخدم مجس حقنة معقمة من ثلاث ملليلتر لتصنيف الأنسجة في تعليق خلية واحدة. نقل الخلايا إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر وجمعها عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من خلايا الدم الحمراء العازلة في ثلاثة إلى أربعة طحال.
بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وغسل الطحال في برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق بيليه في 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تكملها الألبومين مصل البقر واثنين من المليمولار EDTA للعد. بعد ذلك ، قم بعزل الخلايا الإيجابية Ly6 B2 مع الخرز المناعي المناسب وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة وبذرس الخلايا الإيجابية المخصبة Ly6 B2 في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخمس لكل 100 ميكرولترات من المتوسط الكامل لكل كثافة بئر في لوحة سوداء أو بيضاء 96 بئرًا. إعداد inoculum البكتيرية في التعدد المطلوب من العدوى في حجم النهائي من 100 ميكرولترات في البئر وإضافة 100 ميكرولترات من inoculum البكتيرية أو المتوسطة وحدها إلى كل بئر لاحتضان لمدة ساعة واحدة في حاضنة ثقافة الخلية.
في نهاية الحضانة، واستبدال المتوسطة مع 200 ميكرولترات من المتوسط الكامل الطازجة تستكمل مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من النحوم لإزالة أي بكتيريا خارج الخلية المتبقية وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعتين إضافية. في نهاية الحضانة وفي كل نقطة زمنية تجريبية بعد ذلك ، استخدم قارئ لوحة لقياس الإنارة في كل بئر من لوحة الثقافة المصفى قبل إعادة اللوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية حتى القراءة التالية. في حين أن معظم الحيوانات تظهر مستويات عالية من البكتيريا في الدم في 24 ساعة بعد العدوى، وبعض الجراء لديهم بكتيريا منخفضة أو غير قابلة للكشف في الدم، مما يشير إلى إزالة العدوى بحلول هذه النقطة الزمنية.
بالإضافة إلى ذلك، فإن خلايا الزنبية الإيجابية Ly6 B2 الوليدية المصابة بـ E.coli الإنارة الحيوية لمدة ساعة واحدة قبل إزالة البكتيريا خارج الخلية وعلاج الجنزامايسين اللاحقة أعرب عن مستوى عال من الإنارة في ثلاث ساعات التي تنخفض مع مرور الوقت مما يدل على إزالة البكتيريا. ويؤكد التصوير الحي للحيوانات للبكتيريا الإنارة زيادة انتشار البكتيريا ونموها في الجراء الوليدية مع مرور الوقت في 10 و 24 ساعة بعد العدوى. التصوير داخل الرحم بالتزامن مع التصوير المقطعي المجهري يسهل تحديد بؤر العدوى داخل الدماغ والرئتين والأنسجة الطرفية الأخرى.
تظهر رئة بعض الفئران المصابة بشدة مناطق مبهمة تتفق مع الدمج الالتهابي الذي شارك في ترجمة الإشارات البكتيرية المُضاءة. لا يلاحظ هذه المناطق من التكهّن الالتهابي المفترض في الرئتين السيطرة غير المصابة. كما لوحظت زيادة كبيرة في التعبير السيتوكيني الالتهابي نسبة إلى الضوابط في مجموعات inoculum منخفضة وعالية، ويرتبط مع سماكة ملحوظة من الجدار القُدلي، وزيادة نزيف السنخي، والتسلل الالتهابي في هذه الحيوانات.
أهم الأشياء التي يجب تذكرها هي تنفيذ التقنية المناسبة عند إجراء الحقن وإيلاء اهتمام صارم لحديثي الولادة عند إعطاء التخدير. باستخدام هذه التقنية، يمكننا تصور الإنتان الوليدي في الوقت الحقيقي لدراسة التدخلات واستضافة العلاجات الموجهة التي تهدف إلى تحسين الاستجابة المناعية.
