المحاكاة الحيوية الجزيئية هي تقنية حسابية يمكن استخدامها لاستكشاف الحركات الجزيئية ويمكن أن تكشف عن التغيرات التكينية الحاسمة لفهم الوظائف الكيميائية الحيوية والخلوية. من الصعب إجراء التحقيق في مجموعة الحركات الديناميكية التي يمكن الوصول إليها من قبل الجزيئات الكبيرة. استخدام نتائج المحاكاة الحيوية الجزيئية بالتزامن مع البيانات التجريبية يسمح بتقييم أهميتها الوظيفية.
سوف نبرهن على استخدام المحاكاة الديناميكية الجزيئية كيف تؤثر الطفرات التي لوحظت في مرضى السرطان على تأكيدات استهداف EGFR وملزمة لليغاند. لإعداد البرية من نوع apo النشط EGFR لدينا بنية kinase، فتح برنامج التصور Kymera، وتحت القائمة ملف، انقر فوق جلب بواسطة ID.Select قاعدة بيانات بنك بيانات البروتين وتحديد رمز بنك بيانات البروتين 2GS2. لبناء العناصر 2GS2 الهيكلية المفقودة، الحصول على هذه القطاعات من هياكل EGFR الأخرى.
لبناء الغلوتامات الخمسة المتبقية 746 إلى ألانين 750 ELREA حذف في EGFR، انقر فوق المفضلة، والتسلسل، وتظهر تسلسل لفتح تسلسل البرية من نوع 2GS2. وفي إطار التسلسل الناتج، انقر فوق تحرير وإضافة تسلسل لتحديد الحذف تسلسل تنسيق FASTA متحولة. في إطار المحاذاة، حدد البنية والطراز أو علم التهين.
في النافذة المنبثقة، حدد الهيكل المركب 2GS2 كقالب وتسلسل متحول كاستعلام يتم نمذجه، ثم حدد نموذج متحول من النماذج الناتجة استنادًا إلى نقاط zDOPE والفحص البصري. لإعداد البرية من نوع apo غير نشط EGFR كيناز الهيكل، فتح بروتين البيانات البنك هيكل 2GS7 وإضافة شرائح مفقودة من هياكل EGFR الأخرى، نمض نموذج الحذف متحولة كما هو موضح. لإعداد ATP من نوع البرية النشطة هيكل kinase ، استخدم بروتين بيانات البنك هيكل 2ITX كهيكل المبدأ ، وبناء الشرائح المفقودة باستخدام هياكل EGFR أخرى والنمذجة على شكل الحذف متحولة باستخدام نموذج كما هو موضح.
لبناء البرية من نوع EGFR غير المتماثلة الخافتة الخافتة هيكل ، فتح 2GS2 في Kymera وانقر على الأدوات ، أعلى هيكل النظام ، وخلية وحدة لتحويل الهيكل إلى الجمعية البيولوجية التي تحتوي على kinases المنشط والمتلقي في الترتيب غير المتماثلة. حدد هيكل 2GS2 وأدخل نسخًا ، ثم حدد وحفظ خافض واحد غير متماثل من نسخ متعددة من الخافت الناتجة عن عمليات التماثل. لبناء ألانين 702 هريرة فالين، حدد الأدوات، وتحرير الهيكل، و rotamers لتحل محل ألانين 702 مع فالين.
فتح الهياكل في مايسترو وانقر فوق زر معالج إعداد البروتين، ثم حدد إضافة ذرات الهيدروجين وملء في الذرات سلسلة الجانب المفقودة وانقر فوق ما قبل العملية. لتحديد حالات البروتون من المخلفات المؤينة في 7.0 درجة الهيدروجيني، انقر فوق صقل واستخدام PROPKA لتحسين اتجاه الهليون، الجلوتامين، وبقايا الهستامين للترابط الهيدروجين، ثم تقليل الهيكل. لإعداد نظام المحاكاة، افتح برنامج LEAP ثم قم باستيراد حقل القوة الكهرماني FF14SB وجزيئات الماء TIP3P.
بالنسبة للأنظمة المنضمة إلى ATP، قم باستيراد معلمات ATP وتحميل الهيكل. تحل الهيكل في مربع ثماني مع جزيئات الماء TIP3P واضحة التي تمتد 10 angstroms في جميع الاتجاهات من ذرات السطح من البروتين. تحقق من نظام الحزام وإضافة الأيونات اللازمة لتحييده.
20- لكي نُسِّح بشكل كافٍ نظم الجزيئات الحيوية، يضاف إلى صندوق المحاكاة ذرات إضافية من الصوديوم والكلوريد، لكي يصل تركيز الملح للنظام إلى 0.15 مُضَرّ، ثم يُدرِّبُ وحفظَ طبولوجياَ وتنسيقَ ملفات النظام لتكون بمثابة مدخلات لمحاكاة الإنتاج اللاحقة. باستخدام العنبر، في البداية يقلل الطاقة نظام المحاكاة للتحايل على أي تكوينات غير مواتية. في ملف الإدخال التخين، ضبط متغير دورة الحد الأقصى لدورة التخ تصغير إجمالي وعدد الدورات للإشارة إلى عدد الدورات لخوارزمية الهبوط الحاد.
استخدام متغير الوزن ضبط النفس لتطبيق قوة ضبط النفس على ذرات المذابة التي تحددها المعلمة قناع ضبط النفس. تنفيذ التقليل في خطوات متعددة، وخفض تدريجيا ضبط النفس المطبقة على ذرات المذاب من 25 إلى 0 كيلوكالوري في مربع الخلد angstrom، ثم استخدام الأمر لتشغيل التقليل. سخني النظام لـ 100 بيكو ثانية من 0 إلى 300 كلفن واستخدم الأوامر لتعيين 10 كيلو كالوري مولار لكل ضبط النفس في آنستروم مربع على ذرات المذابة.
ثم استخدم الأمر لتنفيذ التدفئة. ضبط النظام ل900 بيكوثانية تحت مجموعة ايزوبارا الحرارية وتعيين تسعة قطع مسافة angstrom للتفاعلات الكهروستاتيكية طويلة المدى ، وخفض تدريجيا ضبط النفس ذرة المذابة إلى 0.1 كيلوكالوري في ساحة الخلد angstrom ووضع اللمسات الأخيرة على التوازن مع محاكاة غير المقيدة خمسة نانو ثانية. تشغيل التساوي مع الأمر كما هو مبين.
ضبط النص للسماح لمحاكاة الإنتاج التي يتعين تنفيذها ل100 نانو ثانية مع التشكلات التي يتم حفظها كل 10 بيكوثانية، ثم تشغيل المحاكاة مع الأمر كما هو مبين. لتصور عينة التشكل أثناء المحاكاة من نوع البرية و متحولة EGFR kinase، افتح ملفات طبولوجيا العنبر وملفات المسار المقابلة في Dynamics الجزيئية البصرية. وباستخدام تمثيلات بنية ثانوية مريحة، وتحليل الديناميات الهيكلية الشاملة للبروتينات من المسار المسجل.
ثم عرض تفاعلات محددة بين الذرات والمخلفات ذات الاهتمام، مثل الجسر الملحي 745-الجلوتامات 762 الأساسي الحفزي. بدلا من ذلك، حفظ التشكلات متعددة عينات خلال محاكاة في شكل بنك بيانات البروتين وفتح التشكلات في Kymera. استخدم خيار الخاطبة لتراكب الهياكل على الهيكل الأولي أو المتوسط وعرض البنية الوسيطة في صلب وبقية الهياكل المحاذية باللون الأبيض الباهت للسماح بالتصور للحركات الهيكلية المسجلة بمزيد من الوضوح.
لتحليل الاستقرار العالمي من نوع البرية و EGFRs متحولة ودراسة مرونة الوحدات الهيكلية المختلفة، استيراد التصنيف الكهرماني وملفات المسار المقابلة. في الجذر يعني مربع الانحراف ملف الإدخال ، تشير إلى الذرات العمود الفقري للهيكل الأولي كمرجع لتعادل الجذر مربع المناسب. في الجذر يعني مربع تقلب ملف الإدخال، تشير إلى ذرات C-ألفا من الهيكل الأولي كمرجع لملاءمة مربعة الوسط الجذر.
ثم قم بتشغيل التحليل مع برنامج CPPTRAJ و رسم بيانات الإخراج. بدلاً من ذلك، لمحاذاة الفرق التشكلية ولتلوين كل بقايا استناداً إلى جذر ذرة C-Alpha يعني الانحراف المربع، افتح التشكلات في كيميرا ومحاذاتها مع خيار الخاطبة. حدد الأدوات، والتصوير، والتجسيد حسب السمة.
حدد بقايا الفرق التكتّن وتعيين الانحراف المربع لجذور C-Alpha كخصائص، ثم انقر فوق موافق. وسوف يكون أثر سلسلة من التشكلات الملونة الأزرق والأبيض والأحمر مما يعكس مناطق عالية ومتوسطة ومنخفضة الاستقرار الهيكلي على التوالي. لتحليل التفاعلات السندات الهيدروجين بين ATP وكلا من نوع البرية وحذف EGFRs، وإعداد برنامج نصي CPPTRAJ لتنفيذ هذه المهمة. حدد التحليل للسندات الهيدروجينية بين الجزيئات فقط مع متغير nointramol وتحديد السندات الهيدروجين مع مسافة قبول المانحين أقل من أو يساوي 3.5 انجستروم وزاوية السندات أكبر من أو يساوي 135 درجة.
لتقييم التفاعلات داخل الغدد المولوية، على سبيل المثال، بين بقايا اللسين والغلوتامات الهامة بشكل تحفيزي، حدد ليسين كمتبرع للهيدروجين والغلوتامات كبقايا المقبول وتشغيل السيناريو كما هو مبين للسماح بتحليل النتيجة. لحساب الطاقات الحرة ملزمة بين ATP وكلا من نوع البرية وحذف EGFRs، وإعداد مستقبلات يغاند مرحلة الغاز ومستقبلات مستقبلات مجمعة ملفات بنك بيانات البروتين في برنامج LEAP وتعيين ATP كما يغاند وEGFR كما مستقبلات. تعيين القيمة الإذاعية المولد تعميم إلى M بوند I2. ثم توليد طبولوجيا العنبر وتنسيق الملفات لمرحلة الغاز بيانات البروتين البنك الملفات.
وبالمثل، لحساب الطاقات الحرة ملزمة بين المنشط والمتلقي kinases من نوع البرية والألانين 702 فالين EGFRs، وتحديد كيناز المتلقي والليغان وkinase المنشط كما مستقبلات وحفظ الطوبولوجيا المقابلة وتنسيق الملفات. إعداد الميكانيكا الجزيئية ولادة ولادة منطقة سطح ملف الإدخال وتعيين قيمة IGB إلى اثنين و saltcon إلى 0.1. ثم استخدام mmpbsa.
py النصي المتاحة في العنبر ، أدخل الأمر كما هو مبين لتنفيذ الحسابات الطاقة ملزمة وتحليل البيانات الناتج. خلال هذا تمثيلية 100 نانو ثانية المحاكاة، وأظهرت ألانين 702 طافة فالين استقرار التشكل زيادة من الجزء juxtamembrane B المرجح بسبب تفاعلات أكثر إحكاماً hydrophobic بالمقارنة مع EGFR من النوع البرية. كما عرضت ألانين 702 هتيرة الفلورين طاقة أقل خالية من الربط بين المنشط وkinases المتلقي نسبة إلى EGFR من النوع البرية، مما يمثل تفاعلات أكثر ملاءمة الخافت التي تحافظ على التشكل كيناز EGFR النشط.
أدت محاكاة الطفرة الحذفية إلى تقلبات ذرة C-Alpha أقل من المفتاح الوظيفي ألفا C-الحلزون بالمقارنة مع EGFR من النوع البري ، مما يطيل وقت الدولة النشطة EGFR. كما أدت طفرة الحذف إلى تكوين متكرر للسندات الهيدروجينية بين الذرات القطبية السلسلة الجانبية لليسين 745 والغلوتامات 762، وهو تفاعل رئيسي للنشاط الأنزيمي EGFR مقارنة بـ EGFR من النوع البري. بالإضافة إلى ذلك، كان عدد الروابط الهيدروجينية بين ATP وEGFR أكبر بالنسبة للمحو الحذف من EGFR من النوع البري.
كما أدت طفرة الحذف إلى حركة داخلية لحالة ألفا سي-هيليكس غير النشطة في EGFR، وهو تغيير هيكلي متوقع أثناء الانتقال إلى الحالة النشطة. وعلى النقيض من ذلك، حافظ ألفا سي-هيليكس من نوع البرية غير نشط EGFR على التشكل الأولي. لتقييم تأثير الطفرات، من المهم اختيار الحالات المطابقة المناسبة للهياكل وإعداد هذه الهياكل وتكدالها بشكل صحيح.
من المهم الجمع بين المحاكاة الديناميكية الجزيئية والدراسات التجريبية حيث أن التآزر بين هذه التقنيات يفيد تفسير النتائج ويمكن أن يفيد تجارب المختبرات الرطبة الإضافية.
