باستخدام هذا البروتوكول، يمكن لأي مختبر يحتوي على مجهر مشترك قياسي مجهز بالليزر 405 نانومتر إجراء الاستئصالات الليزرية لذر الخلية الشعر ومراقبة تجديدها. على عكس الاستئصال الكهربائي، هذه التقنية يحد من الأضرار المحيطة بالخلايا ويمكن الوصول إليها أكثر من إعداد ليزر الأشعة فوق البنفسجية نبضية قوية. كما يمكن إجراء التصوير Confocal مباشرة قبل وبعد الاستئصال.
هذه التقنية تمكننا من فهم أفضل للسلوك التجديدي للنسل الحسي ، والذي قد يساعد في تطوير العلاجات لفقدان السمع البشري. للتركيب ، الماصة الأولى من ثلاثة إلى أربعة يرقات تخدير في قطرة صغيرة من محلول tricaine E3 في وسط طبق 35 ملليمتر ، مع 14 ملليمتر عدد 1.5 غطاء زلة القاع. إزالة الحل الزائد بحيث تبقى اليرقات في قطرة صغيرة فقط كبيرة بما يكفي لاحتوائها.
ووضع الطبق على خشبة المسرح من المجهر ستيريو منظار. عالج التكبير والتركيز بحيث تكون جميع اليرقات في مجال الرؤية وتستخدم ماصة نقل لإضافة طبقة رقيقة من الحل الزراعي على زلة الغطاء. إزالة الزراعة الزائدة حتى السائل فقط يملأ البئر في الجزء السفلي من الطبق، مع الحرص على عدم التعرق أي يرقات.
واستخدام سكين الشعر لتوجيه بسرعة اليرقات في حل الزراعية مع الجانب الرسترالية التي تواجه اليسار. اضغط بلطف على اليرقات إلى أسفل ضد الزجاج ، بحيث تقع اليرقات في ملفها الشخصي مع توجيه جوانبها اليمنى لأسفل. بعد حوالي 60 ثانية ، ستبدأ الزراعة في ترسيخ ولن تتمكن اليرقات من إعادة توجيهها.
بعد خمس دقائق، استخدم ماصة نقل لملء الطبق في منتصف الطريق مع E3 تكملها tricaine 1X. لتحديد الأهداف المحتملة، قم بتشغيل الطاقة إلى نظام المجهر المجهري المسح الضوئي بالليزر و تهيئة الليزر من خلال برنامج التصوير المتكامل. حدد 63X خطة-Apochromat النفط الغمر الهدف وتطبيق زيت الغمر على العدسة.
قم بتأمين الطبق في مرحلة دائرية مع الجانب الرستري لليرقات التي تواجه إلى اليسار. باستخدام حقل مشرق أو التفاضلية التداخل النقيض الإضاءة، حدد واحدة من اليرقات التي شنت للتصوير واستخدام مقبض التركيز لجعل الجلد على جانب السمك الأقرب إلى الغطاء تنزلق إلى التركيز. التبديل إلى الإضاءة الظهارية في قناة GFP وتحديد الخط الجانبي الخلفي بواسطة تعبير GFP على طول myoseptum الأفقي.
حلقات من الخلايا الفلورية هي مؤشرا على خلايا عباءة العصبية وخيوط ممدود من الخلايا هي الخلايا interneuromast. بدءا من أول مهاجرة البدائية العصبية، واستخدام عصا التحكم في المرحلة لمسح بصريا caudally على طول myoseptum الأفقي. بعد سلسلة من الخلايا الأرومية إلى أن يتم الوصول إلى المنطقة بين الثالث والرابع المهاجرة العصبية البدائية.
إذا كان هناك العديد من اليرقات التي يجب تصويرها، حدد الموضع لتعيين موضع المرحلة الأولى. وبعد تحديد أجسام الخلايا في L3، تم تحديد منطقة L4، والتحول إلى وضع الاقتناء واستخدام ليزر مناسب لتنشيط مسار التصوير في GFP. لإضافة قناة ضوء منقولة إلى مسار الليزر المنشط، انقر فوق مربع T-PMT في القائمة المنسدلة لإعداد الصور.
لصورة يرقات ET20 ، حدد الليزر 488 نانومتر ، تعيين قوة الليزر إلى 6 ٪ حجم الثقب إلى وحدة منطقة واحدة مكافئة والمكاسب الرقمية إلى 750. ضبط المكاسب التي يتم تشبعها أجسام الخلية لالتقاط التوقعات قاتمة خلاف ذلك وfilopodia. وتعيين حجم الإطار إلى 1، 024 في 1، 024 بكسل، والمتوسط إلى اثنين والتكبير الرقمي إلى 0.7.
تحقق من المربع Z المكدس لإحضار القائمة المنسدلة موضع Z. أثناء المسح السريع ، ركز حتى تكون خلايا interneuromast خارج التركيز فقط وتعيين الشريحة الأولى. التركيز من خلال العينة حتى الخلايا interneuromast مرة أخرى من التركيز وتعيين الشريحة الأخيرة.
ثم انقر فوق إيقاف وانقر فوق بدء التجربة لالتقاط كومة ما قبل الاستئصال Z. إذا تمت إضافة مواضع المرحلة، قم بإلغاء تنشيط خيار المواضع بحيث يتم تصوير الموضع الحالي فقط وحفظ الملف بمجرد التقاطه. لاجتثاث الليزر من الأجسام الخلية المستهدفة، انقر فوق إظهار كافة الأدوات في واجهة الاكتساب وفي القائمة إعداد التصوير، حدد إضافة مسار جديد.
انقر فوق صبغ وحدد DAPI. ضمن القنوات، حدد 405 لإعداد الليزر وقم بزيادة طاقة الليزر إلى 75٪ Unclick قناة DAPI لإيقاف تشغيل الليزر أثناء المسح الضوئي للأجسام الخلية المرشحة للاستئصال. انقر مباشرة ومع الجسم من خلية interneuromast تركزت في مجال الرؤية، والتكبير في إطار المسح الضوئي إلى 20 إلى 22X.
إيقاف المسح الحي بمجرد أن يملأ جسم الخلية مجال الرؤية. تحقق من 405 نانومتر مربع مصراع الليزر لتنشيط المسار وتعيين جهاز توقيت لمدة 45 ثانية. ثم، قم بتنشيط المسح الضوئي المستمر وبدء المؤقت.
إيقاف المسح الضوئي على الفور في 45 ثانية. للتصوير من الخلايا الأجسام بعد الاستئصال، تحت قائمة القنوات، unclick فوق المسار DAPI إلى تعطيل الليزر الاستئصال وفتح القائمة وضع الاكتساب. انقر فوق التكبير و إنقاص التكبير إلى 0.7.
لتقييم نجاح استئصال الخلية، قم بمسح مجال الرؤية بسرعة. باستخدام نفس الإعدادات مثل تلك الخاصة بتصوير ما قبل الاستئصال، التقاط صورة ما بعد الاستئصال وحفظها. فحص صورة قناة أنبوب المضاعفة الضوئية المُرسلة للضوء للتأكد من الضرر الخلوي.
سوف تظهر الخلايا التالفة مظهر الحبيبية والنوى سوف تنتفخ في كثير من الأحيان أو تظهر غير منتظمة في الشكل. لتقييم استعادة جسم خلية ما بعد الاستئصال، قم بتنشيط كل من موضع المرحلة وخيارات الوقت لالتقاط صورة الفاصل الزمني وتعيين معلمات الوقت على نقطة الوقت التجريبي المناسبة وفترات 15 دقيقة. ثم ابدأ التجربة للحصول على الصور وحفظ الملف الناتج عند اكتماله.
في هذه التجربة التمثيلية، تم تحديد منطقة الخط الجانبي الواقع بين المواليد المهاجرين الثالث والرابع وتم التقاط صور ما قبل الاستئصال. وأكد المسح بعد الاستئصال أنه لم تبق أي جثث خلايا في المنطقة التي تم اجتثاثها. ترك فجوة بين الإسقاطات الممدود من الخلايا المُتَجَلِّلة المُجاورَة.
تحليل قناة أنبوب الmultiptiplier الضوء المنقول بعد الاستئصال، ويكشف عن الخلايا التالفة والموت. تتميز نوى منتفخة وغير منتظمة الشكل ومظهر حبيبي. كما يمكن ملاحظة تعيين الخلايا الأمبويدة الكبيرة التي من المحتمل أن تكون الضامة.
في هذه التجربة ، خلق استئصال العديد من الخلايا في اليرقات المعدلة وراثيا مزدوجة فجوات كبيرة في سلسلة الخلايا الديورومية ، ولكن كان لها تأثير ضئيل أو معدوم على عصب الخط الجانبي. بعد الاستئصال بالليزر، يمكن قياس أحجام الفجوة. تتراوح من مجرد بضعة ميكرونات تصل إلى 100 ميكرون، اعتمادا على العرض الذي يتم اختيار الخلايا العصبية الفردية وعدد الخلايا للاستئصال.
بعد الاستئصال، تتعافى بعض الخلايا المُتداخلة في غضون الساعات الأولى من التصوير. مع احتمال إغلاق الفجوة يرتبط سلبا مع حجم الفجوة. حتى في الخلايا interneuromast التي لا يمكن استرداد ومع ذلك, تشكيل الإسقاطات طويلة من الخلايا المُتَوَلِّقِة المجاورة, التي يمكن أن تشبه توسيع مخاريط النمو العصبي يمكن ملاحظتها.
من المهم فحص قناة T-PMT بدقة للخلايا التالفة التي تظهر نوى و حبيبية غير منتظمة، وإتاحة وقت كافٍ لهذه المؤشرات لموت الخلايا لتصبح مرئية. ويمكن أن يكشف المزيد من التحليل لبيانات المجهر الناتجة عن الفواصل الزمنية، سلوكيات خلوية جديدة ناجمة عن الاستئصال بالليزر، وقد يوجه عملية تطوير التجارب لتحديد منظمي التجديد. وقد مكنتنا هذه التقنية من دراسة المنظمين الجزيئيين لتجديد الخلايا الزناة من خلال توفير طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لإتلاف هذه الخلايا بشكل انتقائي.
