نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتقييم الخصائص المجزية أو الكارهة للتحفيز الوراثي لمنطقة معينة من الدماغ. يمكن لهذه التقنية الإجابة بسرعة إذا كان تحفيز خلايا معينة مجزية أو غير مجزية. نحن وصف الإعداد لتحفيز منطقة البطن tegmental ولكن يمكن بسهولة تكييف بروتوكولاتنا لتغيير معلمات محددة من حيث المناطق المختلفة التي تمت دراستها.
للبدء، استخدم أجهزة التحكم الدقيقة ذات اللوحة الواحدة للتحكم في مصدر الليزر. تحميل البرنامج النصي على متن متحكم دقيق باستخدام كابل الاتصال المناسب إلى الكمبيوتر. يتضمن البرنامج النصي التشكيل الخارجي القادمة من برنامج التتبع من خلال مربع TTL ، وإخراج الليزر للتحكم في معلمات التحفيز.
استخدم كبل شبكة اتصال لتوصيل مربع TTL باللوحة. تأكد من تعيين الليزر للتحكم عن طريق التشكيل الخارجي، وتوصيل الليزر باللوحة باستخدام كابل FC/PC. قم بتوصيل الدبابيس المناسبة إلى الأجزاء الأرضية من اللوحة.
لتوصيل مصدر الليزر بالألياف البصرية، قم أولاً بتوصيل مصدر الليزر بمفصل دوار. قم بتوصيل سلك التصحيح بالمفصل الدوار. تحقيق الاستقرار في المفصل الدوار فوق الجهاز، ولكن خارج منطقة التسجيل.
تأكد من طول الحبل التصحيح الألياف البصرية هو المناسب للسماح للماوس للتحرك دون صعوبات في الساحة. لمعايرة الإعداد الساحة، استخدم مسطرة لقياس جزء معين من الجهاز المادي. في البرنامج، رسم خط المقابلة للجزء الذي تم قياسه.
ضمن علامة التبويب رسم مقياس لمعايرة، أدخل القيمة المعروفة بالفعل. تصميم الساحة ، ورسم المنطقة التي سيتم تسجيل حركة الفئران. إنشاء المناطق، رسم المناطق التي سيتم تعيينها في نهاية المطاف كما الليزر-الاقتران، ليزر-غير م ولايريد، ومحايدة.
اضغط الزر التحقق من صحة الإعداد للتحقق من صحة الإعداد للتأكد من عدم وجود معلمات متعارضة، على سبيل المثال، مناطق خارج الساحة. تأكد من تمكين عنصر تحكم الأجهزة، ثم قم بتعيين وقت التجربة إلى 30 دقيقة، إلى خيار تكرار السمسم في إعدادات مربع المرجع. تعيين مقصورة كما الليزر-الاقتران، في إدخال الماوس الذي سيؤدي إشارة TTL من خلال تتبع البرمجيات إلى متن متحكم في الدقيقة تحت إعدادات الشرط.
لتعديل الإعداد لنهج تفضيل المقصورة المحايدة، بعد إعداد الساحة والوقت، قم بتعيين منطقتي A و B كـ laser-paired عن طريق إضافة نقطة الوسط في أي من المنطقة A والمنطقة B لمربع الشرط المرتبط بإعدادات مقصورتي A و B. لإعداد إعدادات الكشف عن استخدام دمية لتشبه الماوس. ضع الدمية في مقصورة واحدة من الجهاز، واستخدم الإعداد التلقائي مع الطرح الديناميكي.
إزالة دمية ووضعها في المقصورة المقابلة. تأكد من الكشف عن الدمية بشكل كامل. ضع الدمية في المقصورة التي إقرانها الليزر.
للتحقق مما إذا كان التحفيز يعمل، ابدأ في الحصول على استخدام إعدادات التحكم التجريبية التي تم تكوينها مسبقًا ومعرفة ما إذا كان التحفيز قد تم تشغيله كما يجب. ثم ضع الدمية في المقصورة غير المُجَدَّدة أو المحايدة، ونرى ما إذا كان التحفيز قد توقف أم لا. استخدم مقبض الباب على الليزر لتعيين قوة الليزر إلى 10 مللي واط.
قم بتوصيل غرسة الألياف البصرية بحبل الألياف البصرية باستخدام كم من السيراميك، ووضع الماوس في المقصورة المحايدة للجهاز الثلاثي المقصورة. انتظر حتى يتم الكشف عن الماوس من قبل البرنامج. إزالة أبواب انزلاق عمودي تقييد الحيوان من دخول المقصورات الرئيسية.
السماح للحيوان لاستكشاف بحرية دون أي إزعاج. كامل تجربة تفضيل المكان في الوقت الحقيقي تجري طوال ثماني جلسات. تم اختبار الفئران DAT-Cre حقنها مع فيروس AAV channelrhodopsin EYFP في منطقة تيغمنتال البطني لاستهداف الخلايا العصبية الدوبامين.
قضى الفئران في المتوسط حوالي 70٪ من وقتهم في المقصورة بالليزر المقترنة، بدلا من المقصورة غير المدفوعة في 20٪، والمقصورة المحايدة في 10٪ لوحظ نمط ظاهري سلوكي معاكس مع الفئران Vglut2-Cre حقنها مع AAV channelrhodopsin EYFP في منطقة تيغمنتال البطنية. تجنبت الفئران المقصورة مقترنة بالتحفيز ، وأمضت المزيد من الوقت في الـ"غير مُؤمّن". خلال أيام الردود المشروطة خمسة وثمانية أيام، لم تظهر الفئران تجنب واضح للحجرة التي تم إقرانها سابقًا.
لمزيد من إثبات دور مجزية أو aversive من خلايا عصبية معينة، يمكن أن تكمل الأسلوب الموصوفة مع أساليب أخرى مثل نماذج أوبرون، أو التحفيز الفرعية الضوئية. انتبه أثناء التعامل مع الفيروسات وعند استخدام مصادر الليزر.
