Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من الميزانية الأساسية من P53lab (BMSI ، A * STAR) ومنحة JCO VIP (A * STAR).

HEK293 تم استخدام خط الخلية للبروتوكول وكان مثقفا في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني، 2 MM L-الجلوتامين، و 100 U/mL البنسلين / العقديبتوميسين. تم استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون فيبيئة رطبة.
1. التقييم الكمي للاضطراب المعقد eIF4F عن طريق eIF4E:eIF4G604-646 اختبار الاستكمال
<ol><li>زراعة الخلايا والإصابة العابرة ل eIF4E:eIF4G604-646 اختبار الاستكمال<ol>
<li>استخدم خلايا مذابة حديثا مع أقل من 20 مقطعا لجميع التجارب. في اليوم الأول، حدد رقم الخلية باستخدام عداد خلية قياسي واحسب إجمالي الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد Trypan الزرقاء13.</li>
		<li>لوحات البذور 6-جيدا مع 0.9 - 1.2 × 106 من خلايا HEK 293 لكل بئر في 2 مل من متوسط النمو القياسي. ملاحظة: من أجل تحقيق أفضل كفاءة في العدوى داخل خطوط الخلية المشار إليها أعلاه، تأكد من أن الخلايا المطلية هي التقاء 70-90٪ في اليوم التالي للبذر.</li>
		<li>في صباح اليوم 2، خلايا العدوى المشتركة مع SubA-eIF4E و eIF4G604-646-SubB plasmid باستخدام كاشف العدوى القائم على الدهون (انظر جدول المواد)كما هو موضح أدناه.<ol>
<li>تمييع 9 ميكرولتر من محلول الليبوسوم القائم في أنبوب يحتوي على 125 ميكرولتر من متوسط المصل المنخفض بدون فينول أحمر (انظر جدول المواد)لكل عملية إصابة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
			<li>إعداد مزيج رئيسي من الحمض النووي عن طريق تخفيف 3 ميكروغرام من كلplasmid في 125 ميكروغرام من انخفاض متوسط المصل لكل أنبوب العدوى.</li>
			<li>إضافة 12 ميكرولتر من الكواشف محسن إلى أنبوب مزيج الحمض النووي الرئيسي، مزيج جيدا وإضافة الحمض النووي على الفور: محسن مزيج رئيسي إلى كل أنبوب من الليبوسومات المخففة في نسبة 1:1. حضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
			<li>إضافة مجمع الحمض النووي الدهون إلى كل بئر واحتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.</li>
		</ol>
</li>
		<li>في صباح اليوم 3، شطف كل بئر مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا في كل بئر مع 0.3 مل من التريبسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>تحييد التربسين بإضافة 2 مل من متوسط المصل المنخفض دون فينول أحمر يحتوي على 0٪ FCS في كل بئر ونقل الخلايا المصابة إلى أنبوب 15 مل. ملاحظة: فينول الأحمر يمكن أن تتداخل مع نشاط لوسيفيراز; لذلك، يجب معالجة الخلايا من هذه الخطوة فصاعدا في المتوسط دون فينول الأحمر.</li>
		<li>قم بتدبير الخلايا لمدة 5 دقائق عند 290 × ز ونسخ الوسط. Resuspend الخلايا في 2 مل من المتوسط المصل انخفاض دون فينول الأحمر التي تحتوي على 0٪ FCS. عد كما هو موضح في الخطوة 1.1.</li>
		<li>البذور المصابة HEK 293 الخلايا في 96 لوحات مبهمة جيدا في كثافة 30،000 خلية لكل بئر في 90 ميكرولتر من المتوسط دون فينول الأحمر التي تحتوي على 0٪ FCS. من أجل الحصول على 3 تكرارات تقنية في نفس التجربة ل 3 مركبات مختلفة ، بذور 60 بئرا من اللوحات مع خلايا باستثناء الآبار على الحواف.</li>
		<li>مباشرة بعد البذر الخلايا المصابة، إضافة 10 ميكرولتر من محلول مركب DMSO 10٪ (انظر الخطوة 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد المركب<ol>
<li>إعداد 1 MM حلول المخزون المركب عن طريق حل مجمع الفائدة في 100٪ DMSO (v/v). من أجل الحصول على 3 نسخ متماثلة لكل معيرة مركبة ، استخدم 8 ميكرولتر من محلول المخزون المركب 1 mM. ملاحظة: حجم مركب المخزون 1 mM المستخدمة هو أكثر من ما هو مطلوب. ويتم ذلك لتأخذ في الاعتبار أخطاء ماصة إن وجدت.</li>
		<li>تنفيذ 2 أضعاف المخفف التسلسلي للمحلول مركب الأسهم مع 4 ميكرولتر من المخزون 1 mM إلى 4 ميكرولتر من DMSO 100٪ لكل نقطة المعايرة. ملاحظة: للحصول على المعايرة المركبة كاملة، تنفيذ 9 المخففات التسلسلية من المخزون بدءا في DMSO 100٪. إذا كانت هناك حاجة إلى اختبار مركبات متعددة، استخدم لوحة بئر 96 وماصة متعددة القنوات لتسهيل هذه الخطوة والتخفيفات اللاحقة.</li>
		<li>إضافة 36 ميكرولتر من HPLC الصف المياه العقيمة لكل نقطة من تخفيف المسلسل 2 أضعاف لإعداد 40 ميكرولتر من حلول العمل 10x في 10٪ DMSO (v/v) (أي. 100 μM إلى 0.39 ميكرومتر 10٪ سلسلة أسهم DMSO ستؤدي إلى حل نهائي من 10 ميكرومتر إلى 0.039 ميكرومتر، في 1٪ DMSO عند إضافتها إلى الخلايا). أما بالنسبة للسيطرة على العلاج، وإعداد أيضا 10٪ DMSO الأسهم الحل فقط في المياه العقيمة HPLC الصف.</li>
		<li>إضافة 10 ميكرولتر من حلول العمل 10x إلى الخلايا في لوحة 96 مبهمة جيدا من أجل تحقيق التركيز النهائي المقصود مع تركيز DMSO المتبقية من 1٪ (v/v) في حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر واحتضان لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ v/vCO2في الغلاف الجوي .</li>
	</ol></li>
	<li>لوكيفيراز تكملة وثبات البقاء<ol>
<li>بعد 3 ساعة من المخدرات، والبدء في إعداد كاشف الركيزة لوسيفيراز عن طريق الجمع بين 1 حجم الركيزة مع 19 مجلدا من كاشف التخفيف (انظر تعليمات الشركة المصنعة). ملاحظة: يتم إجراء المقايسة لوسيفيراز باستخدام عدة متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد).</li>
		<li>استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 25 ميكرولتر من كاشف الركيزة على الفور.</li>
		<li>يهز لوحة في 350 دورة في الدقيقة لمدة 50 دقيقة على شاكر المدارية في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>تقييم التلألؤ باستخدام قارئ لوحة. للقيام بذلك، تعيين قارئ المرآة على التلألؤ ومرشح الانبعاثات على 455. استخدم ارتفاع قياس 6.5 مم مع وقت قياس قدره 1 s.</li>
		<li>من أجل تقييم صلاحية الخلية ، أضف 33 ميكرولتر من كاشف فحص الجدوى ثم إعادة قياس التلألؤ مرة أخرى بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، باستخدام قارئ اللوحة.</li>
		<li>تقييم التلألؤ مع قارئ لوحة عن طريق وضع قارئ المرآة على التلألؤ ومرشح الانبعاثات على 600 نانومتر. استخدم ارتفاع قياس 6.5 مم مع وقت قياس قدره 1 s. ملاحظة: يتم تقييم الجدوى عن طريق قياس مستوى ATP داخل الخلايا عند تحلل الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تعدد ممكن في هذه الحالة منذ المقايسة صلاحية يستخدم لوسيفيراز مختلفة مع الطول الموجي انبعاث مختلفة.</li>
		<li>استخدم البيانات لتحديد قيم IC50 لكل مركب بواسطة منحنى يتناسب مع البيانات إلى معادلة منحنى 4 معلمات مناسبة: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D يجب تقييد القيم الرقمية D و A في عملية تركيب المنحنى: D = القيمة الإنارة على محور ص للحصول على الحد الأدنى من المنحنى غير المكتئب أو الحد الأدنى من المستوى النظري للاستجابة المتوقع من مقايسة الإكمال eIF4E:4G. A = قيمة الإنارة على محور Y للحصول على أقصى قدر من المنحنى غير المكتئب أو استجابة المستوى النظري الأقصى المتوقعة من مقايسة التكامل eIF4E:4G. ملاحظة: يتم اشتقاق قيمة الاستجابة الأدنى من علاج التحكم DMSO (v/v) 1٪ ويتم اشتقاق قيمة الاستجابة القصوى من الاستجابة القصوى لمثبط mTOR عالي التقارب الذي استقر دون أي تأثير على صلاحية الخلية.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ربط eIF4E: eIF4G604-646 تثبيط المقايسة مع اضطراب eIF4F المعقدة في الخلايا
<ol><li>للتأكد من أن الإشارة التي يتم قياسها بالتقييس تتوافق مع التعطيل المادي لتفاعل eIF4E-eIF4G من قبل المركب ، خلايا البذور كما هو موضح في الخطوة 1.1.</li>
	<li>في اليوم التالي، استبدل الوسط ب 1 مل من متوسط المصل المخفض الذي لا يحتوي على الفينول الأحمر واحتضانه لمدة 4 ساعة مع مركب الفائدة. ضمان تركيز DMSO المتبقي بنسبة 1٪ (v/v) في حجم إجمالي قدره 1 مل. ملاحظة: من أجل السماح بسهولة ارتباط مع النتيجة, استخدام تركيزات مركب في بداية, نقطة الوسط ونقطة النهاية من قياس الاستكمال المقايسة منحنى المعايرة.</li>
	<li>خلايا الليس وأداء M7GTP سحب لأسفل لعزل eIF4F و eIF4E: 4EBP1 المجمعات. ويمكن الاطلاع على إجراءات مفصلة حول كيفية تنفيذ M7GTP سحب أسفل التجربة في مكان آخر14.</li>
	<li>الكشف عن M7GTP ملزمة eIF4G, eIF4E و 4EBP1 مستويات البروتين عن طريق تحليل لطخة الغربية, ومن ثم ترتبط تعطل eIF4F المعقدة مع تثبيط إشارة المقايسة التكميلية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

تستخدم الطريقة الموضحة في هذه المقالة م المقايسة التكميلية المستندة إلى لوسيفيراز لرصد التجميع المعقد eIF4F كميا من خلال القياس المباشر لتفاعل eIF4G-eIF4E في الخلايا الحية. لقد قدمنا تفاصيل لاستخدام نظام إكمال eIF4E-eIF4G وأظهرنا أيضا أن النظام دقيق للغاية في قياس التفكك بوساطة 4EBP1 الناجم عن المخدرات للتفاعل eIF4E-eIF4G16. من أجل تسهيل الإنتاجية لهذا المقايسة، تم تصميم الإعداد التجريبي الموصوف في هذه المقالة لاستخدام تنسيق 96 microplate جيدا.
للحصول على أفضل النتائج، ينبغي النظر في خطوتين حاسمتين عند إجراء الفحص. أولا، ينبغي أن تظل كفاءة العدوى بين التجارب متشابهة. ويمكن ضمان ذلك من خلال استخدام خلايا عدد المرور المنخفض، ومن خلال عد الخلايا بدقة في يوم البذر. وينبغي أيضا تقييم التقاء الخلايا قبل إجراء نقل الحمض النووي، حيث لا ينصح بإصابة الخلايا مع كاشف العدوى القائم على الدهون إذا كان التقاء الخلايا أقل من 70-90٪. ثانيا، من المهم مضاعفة المقايسة التكميلية مع اختبار صلاحية الخلية. قد تؤثر بعض المركبات على إشارة لوسيفيراز في المقام الأول عن طريق تقليل عدد الخلايا القابلة للحياة من خلال الآثار الضارة. ولذلك، من المهم قياس صلاحية الخلية مباشرة بعد إجراء اختبار الاستكمال eIF4E:eIF4G604-646 لمعالجة الآثار غير المستهدفة وغير المحددة.
واجهات البروتين والبروتين، مثل واحد بين eIF4E و eIF4G، التي تخلو من الشقوق الكارهة للماء وكبيرة نسبيا وبلانار، تعتبر عموما أن تكون "غير مخدرة" من قبل العلاجية جزيء صغير التقليدية (< 500 ميغاواط)17. وبالتالي، هناك اهتمام متزايد في تطوير طرائق جديدة تتفاعل بكفاءة مع هذا النوع من السطوح (مثل المركبات الكلية الكيسية والبيبتيدوميميتيك). ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الطرائق الجديدة ليست قادرة بشكل فطري على عبور غشاء الخلية وإشراك هدفها. وللالتفاف على هذه القضايا، تجري العديد من مجموعات البحث أبحاثا حول تحسين المواد الكيميائية الجديدة واستراتيجيات توصيل الخلايا. ونحن نتصور أن eIF4E:eIF4G604-646 فحص PPI الخلية الحية وغيرها من المقايسات المماثلة PPI المستمدة سوف تلعب دورا محوريا في تعزيز هذه الاستراتيجيات والتحقق من صحتها.

تلعب السيطرة على التعبير الجيني دورا محوريا في التنفيذ الصحيح للبرامج الخلوية مثل انتشار النمو والتمايز. يمكن أن تمارس آلية الرقابة التنظيمية إما على مستوى النسخ الجيني أو على مستوى ترجمة الحمض النووي الريبي. في العقد الماضي ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التحكم التحويلي عن طريق تعديل عملية البدء بدلا من الخطوات اللاحقة للاستطالة والإنهاء يمكن أن ينظم بدقة تركيب مجموعات فرعية محددة من البروتينات التي تلعب مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية.
وقد تورطت زيادة ترجمة mRNAs المشاركة في البقاء على قيد الحياة، والاستجابات المضادة ل autophagic ومكافحة المبرمج في العديد من أنواع السرطان وارتبطت أيضا بشكل سببي إما تنشيط منحرفة أو أكثر من التعبير عن عوامل بدء الترجمة1.
مجمع eIF4F هو المنظم الرئيسي لبدء الترجمة. من خلال ربط هيكل الحد الأقصى على نهاية 5 'من mRNAs، eIF4F يقود التوظيف الأولي مرنا-ريبوسوم وبالتالي زيادة كفاءة الترجمة مرنا من mRNAs eukaryotic ترجمة ضعيفة2. تم الإبلاغ عن ترجمة eIF4F بوساطة من mRNAs المرتبطة بالسرطان للعديد من نماذج السرطان التي تؤوي التنشيط الشاذ لمسارات RAS /MAPK أو AKT / TOR ، مما يشير إلى أن الخلايا السرطانية ترفع eIF4F لتعزيز نشاطها المؤيد للأورام. تعطيل هذه الحلقة تغذية إلى الأمام عن طريق تثبيط تشكيل eIF4F المعقدة وبالتالي استراتيجية علاجية واعدة جدا3،4.
يتكون مجمع eIF4F من (i) eIF4E ، الوحدة الفرعية الملزمة للغطاء eIF4F التي تتفاعل مع هيكل الغطاء الموجود في UTR 5 من mRNA ، (ii) eIF4A ، وحقيبة طائرات RNA و (3) eIF4G ، بروتين السقالة الذي يتفاعل مع كل من eIF4A و eIF4E والذي يجند في نهاية المطاف 40S ribosomal subunit5. ارتباط eIF4G مع eIF4E هو خطوة الحد من معدل لتجميع المجمعات eIF4F وظيفية وينظم سلبا من قبل eIF4E ملزمة البروتينات (4EBPs، أعضاء 1 و 2 و 3))6. من خلال التنافس مع ربط eIF4G إلى eIF4E من خلال واجهة تتكون من تسلسلات ربط eIF4E الكنسية وغير الكنسية7و8و9 (منطقة تمتد aa 604-646 على eIF4E البشري) ، يقلل 4EBP من مجموعة eIF4E المشاركة بنشاط في الترجمة ومنع تشكيل eIF4F المعقد. يتم تنظيم التفاعل بين هذه التفاعلات البروتين البروتين أساسا من قبل هدف الثدييات من راباميسين (mTOR) بوساطة الفوسفور من 4EBP. على المحفزات mitogenic، mTOR الفوسفور مباشرة أعضاء الأسرة البروتين 4E-BP، وخفض ارتباطهم مع eIF4E، وبالتالي، وتعزيز التفاعل eIF4E-eIF4G وتشكيل مجمعات eIF4F وظيفية10.
على الرغم من الجهد الكبير في تطوير المركبات التي تستهدف سلامة eIF4F المعقدة ، فإن عدم وجود مقايسات تقيس التعطيل المباشر لتفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية قد حد من البحث عن مركبات ضرب نشطة خلوية. لقد طبقنا فحص لوسيفيراز على أساس تناظري coelenterazine (على سبيل المثال، فحص التكامل القائم على Nanoluc) لمراقبة حالة سلامة eIF4F في الوقت الحقيقي من خلال تفاعل eIF4E-eIF4G. يتكون نظام بروتين مكمل لوسيفيراز من جزء بروتين 18 kDa (SubA) و 11 جزء ببتيد من الأحماض الأمينية (SubB) تم تحسينه لتحقيق الحد الأدنى من الارتباط الذاتي والاستقرار11. مرة واحدة أعرب عن منتج الانصهار مع eIF4E طول الإنسان الكامل والمجال التفاعل eIF4E من eiF4G1 الإنسان (aa 604-646)، واثنين من البروتينات التفاعل سوف تجلب SubA وS subB جزء في القرب من بعضها البعض، وسوف تحفز على تشكيل لوسيفيراز النشطة التي، في وجود خلية نفاذية الركيزة، وسوف تولد في نهاية المطاف إشارة مضيئة(الشكل 1). لقد أبلغنا في مكان آخر عن بناء وإقرار eIF4E:eIF4G604-646 نظام استكمال16.
هنا، نقوم بوصف كيف يمكن تطبيق نظام إكمال eIF4E:eIF4G604-646 (متوفر عند الطلب) لقياس اضطراب eIF4E-eIF4G بوساطة 4EBP1 بدقة في الخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نثبت فائدتها من خلال قياس آثار العديد من مثبطات mTOR التي تخضع حاليا للتجارب السريرية والأدوية العلاجية المحتملة للسرطان12. ولأن الآثار خارج الهدف غالبا ما تخفي نشاطا خاصا بالعقاقير، فإننا نصف أيضا كيف يمكن توسيع نطاق تعدد استخدامات قياس نظام eIF4E:eIF4G604-646 مع القياسات المتعامدة للقدرة على البقاء الخلوية لأخذ هذه القياسات في الاعتبار.

<table><tbody><tr><td>293FT cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td><td>greiner bio-one</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>Cell titer Glo 2.0</td><td>PROMEGA</td><td>G9241</td><td></td></tr><tr><td>Envision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>not applcable</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662050</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE6</td><td>PROMEGA</td><td>E2692</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;L3000015&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI Starter Systems</td><td>PROMEGA</td><td>N2014</td><td></td></tr><tr><td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Eppendorf</td><td>not appicable</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP (C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-spacer)-Agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-155S</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

وقد تبين أن تشكيل مجمع eIF4F هو العقدة الرئيسية في المصب للتقارب بين مسارات الإشارات التي غالبا ما تخضع للتنشيط على نحو غير مركب في البشر. eIF4F هو مجمع ربط الحد الأقصى المشاركة في مرحلة التوظيف مرنا-ريبوسوم من بدء الترجمة. في العديد من النماذج الخلوية وما قبل السريرية للسرطانات ، يؤدي إلغاء تحرير eIF4F إلى زيادة ترجمة مجموعات فرعية محددة من الحمض النووي الريبي تشارك في انتشار السرطان والبقاء على قيد الحياة. eIF4F هو مجمع ثلاثي التريك مبني من وحدة ربط الغطاء الفرعية eIF4E ، وeIF4A helicase والوحدات الفرعية للسقالات eIF4G. حاسمة لتجميع مجمعات eIF4F النشطة هو التفاعل البروتين البروتين بين eIF4E والبروتينات eIF4G. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول لقياس تجميع eIF4F الذي يراقب حالة تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية. كما يسمح اختبار التفاعل بين البروتين البروتيني القائم على الخلايا eIF4e:4G بتقييم التغيرات الناجمة عن المخدرات في سلامة eIF4F المعقدة بدقة وموثوقية. ونحن نتصور أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها للتحقق من نشاط المركبات المتاحة تجاريا أو لمزيد من الفحص للمركبات أو الطرائق الجديدة التي تعطل بكفاءة تشكيل مجمع eIF4F.

من أجل التحقق من صحة حساسية eIF4E:eIF4G604-646 نظام الاستكمال، تم تقييم 4EBP1 تثبيط الجمعية المعقدة eIF4F باستخدام مثبطات mTOR. عن طريق تثبيط mTORC1 كيناز الفوسفور تعتمد على الأسرة البروتين 4EBP، تثبيط mTOR يعزز ارتباط 4EBP1 إلى eIF4E، وبالتالي، eIF4F تفكيك15. تم اختبار فئتين من مثبط مختلف ميكانيكيا من kinases mTOR: rapalogs (على سبيل المثال، Rapamycin) التي هي مثبطات allosteric من mTORC1 ولكن ليس mTORC2 ومثبطات ATP القائمة على المنافسة (على سبيل المثال، PP242) التي تم تصميمها لتثبيط على وجه التحديد كل من mTORC1 و mTORC2 كيناز النشاط الحفاز.
تم تحويل خلايا HEK293 مع eIF4E:eIF4G604-646 نظام استكمال كما هو موضح في الخطوة 1. بعد 24 ساعة من العدوى، تم إعادة زرع الخلايا وعلاجها بمثبطات mTOR PP242 و rapamycin (كما هو موضح في الخطوة 1.2). بعد أربع ساعات من العلاج، تم تقييم التلألؤ، كما هو موضح سابقا، تليها صلاحية الخلية. وكما هو مبين في الشكل 2، تنتج PP242 تثبيط تعتمد على الجرعة للإشارة مع IC50 محسوبة من 0.72 ± 0.04 ميكرومتر ، في حين يتم اشتقاق IC50 من 6.88 ± 0.88 ميكرومتر لراباميسين (الشكل 2A). لوحات ثم متعددة لقابلية البقاء الخلوية المقايسة (الشكل 2D). ويبين هذا التحليل أن لا PP242 ولا rapamycin تنتج انخفاضا كبيرا في صلاحية الخلية، مما يثبت أن الانخفاض في التلألؤ في eIF4E:eIF4G604-646 نظام استكمال ليس بسبب وفاة الخلية غير محددة ولكن بدلا من ذلك من خلال تعطيل التفاعل eIF4E:4G.
M7GTP سحب أسفل التجربة التي أجريت عن طريق احتضان الخلايا غير المصابة مع تركيزات مركبة التي تتوافق مع نقاط البداية والمتوسطة والنهاية من منحنى المعايرة المقاسة في الشكل 2A تظهر أن اضطراب 4EBP1 بوساطة من التفاعل eIF4E-eIF4G الذاتية يرتبط مع قياس eIF4E:eIF4G604-646 إشارة التماثل (الشكل 2B, 2C). بما يتفق مع هذه النتائج، يظهر PP242 أن يكون مثبط أكثر فعالية من مجموع الفوسفور 4EBP1 من راباميسين في ظل الظروف التجريبية التي تم اختبارها في خلايا HEK 293 (الشكل 3A)،في حين أظهرت كل من المثبطات تأثير على إشارات mTOR عادة، مع راباميسين يجري أكثر نشاطا ضد ركائز mTORC1 وPP242 تستهدف كل من mTORC1 و mTORC2 (الشكل 3B).
وأظهرت هذه النتائج مجتمعة أن PP242 هو أكثر فعالية في تعطيل تشكيل eIF4F المعقدة من راباميسين في خلايا HEK293 ومزيد من إثبات أن eIF4E:eIF4G604-646 نظام يمكن قياس بدقة eIF4F التجميع المعقد في الخلايا الحية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig1.jpg"> الشكل 1: eIF4E:eIF4G604-646 نظام الاستكمال. تمثيل تخطيطي يبين كيف أن تفاعل البروتين X (eIF4E) والبروتين Y (eIF4G604-646)يمكن اندماجات SubA و SubB من الاقتراب من بعضها البعض وإعادة تشكيل لوسيفيراز النشط. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig2.jpg"> الشكل 2: تعطيل مجمع eIF4F بوساطة 4EBP1. (أ)PP242 و rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 المقايسة المعايرة نمذجة التفاعل بين eIF4E و eIF4G في خلايا HEK 293 المصابة. (B, C) تحليل لطخة الغربية التي تبين المستوى الداخلي من eIF4E، eIF4G و 4EBP1 في مقتطفات HEK 293 وفي M7GTP سحب أسفل بعد حضانة الخلايا المستزرعة مع تركيز مختلف من PP242 أو راباميسين على التوالي. (د)الخلايا المعالجة في A حيث تم تقييم تعدد مرات بقاء الخلية والتلألؤ. تمثل كافة القيم متوسط ± SD (n = 3). وقد تم تعديل هذا الرقم من16. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig3.jpg"> الشكل 3: التأثير التفاضلي لتثبيط mTOR على 4EBP1 phoshorylation. (أ)تحليل لطخة الغربية لحالة الفوسفور من 4EBP1 في خلايا HEK293 غير المصابة تعامل مع تركيز المشار إليها من PP242 وراباميسين. (ب)تحليل لطخة الغربية من حالة الفوسفور AKT و S6 في خلايا HEK293 غير المصابة تعامل إما مع مثبطات الموقع النشط MTORC1/2 المزدوج PP242، أو مثبط الألستيريك من mTORC1 Rapamycin. تم تصور بيتا أكتين للتحكم في التحميل وكذلك إجمالي 4EBP1 و AKT و S6. وقد تم تعديل هذا الرقم من16. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية من شأنه أن يمكن المستخدم من تقييم الاضطراب الناجم عن المخدرات للديناميكيات المعقدة eIF4F في أشكال الفحص.

مراقبة تجميع eIF4F من خلال قياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Views.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية من شأنه أن يمكن المستخدم من تقييم الاضطراب الناجم عن المخدرات للديناميكيات المعقدة eIF4F في أشكال الفحص.

Video: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genetics

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Biochemistry

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biology

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Immunology and Infection

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

تحديد الشركاء التفاعل البروتين في خلايا الثدييات عن طريق SILAC مناعي الكمي البروتيوميات

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

A عالية الدقة الطريقة لرصد تفعيل الفسفرة التي تعتمد من IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...