المبيضات albicans الأغشية الحيوية مثل العديد من العينات البيولوجية شفافة بشكل كبير إلى مبهمة في حالتها الأصلية. في هذه البروتوكولات، نظهر أنه باستخدام أساليب التوضيح، يمكن تصوير البنية الداخلية للأغشية الحيوية الثابتة السليمة عن طريق المجهر المقطع البصري. مع خطوات معالجة بسيطة وغير مكلفة وسريعة نسبيًا ، يمكن جعل الأغشية الحيوية الثابتة سليمة شفافة للتصوير ثلاثي الأبعاد عن طريق المجهر الفلوري المنافق.
إظهار هذا الإجراء اليوم سيكون كاتي Lagree، باحثة ما بعد الدكتوراه هنا،. لبدء نمو بيو فيلم في لوحة 12-جيدا، وإعداد لوحة كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع الطبق على خلاط مداري 60 دورة في الدقيقة في حاضنة هواء مرطبة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لإتاحة الوقت للتصاق الخلية.
بعد 90 دقيقة، قم بإزالة الخلايا المتوسطة وغير المرتبطة واغسلها بوسيط معقمة أو PBS. نقل ركائز مطعّم إلى آخر لوحة متعددة جيدا تحتوي على قبل الدافئة خيط المتوسطة. العودة إلى لوحة 37 درجة مئوية ترطيب حاضنة الهواء المحيط وتنمو الأغشية الحيوية تصل إلى 48 ساعة مع 60 دورة في الدقيقة خلط المدارية للتهوية.
استرداد لوحة 48 ساعة من الحاضنة وإزالة المتوسطة الثقافة من كل عينة. استبدال المتوسطة مع برنامج تلفزيوني واحتضان لعدة دقائق لتخفيف البروتينات المصل بعيدا. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، إعادة ملء الآبار مع المثبت.
وينبغي إضافة حجم تثبيت كافية لكل طبق لتغمر جميع بيو فيلم النمو بما في ذلك أي على الجوانب الداخلية للطبق. تعيين الطبق المغطى على خلاط المداري بطيئة لمدة 20 دقيقة. بعد إزالة المثبت كما هو موضح في بروتوكول النص ، والاستعداد للتلوين عن طريق استنزاف برنامج تلفزيوني وإعادة ملء الآبار بسرعة مع حل يحتوي على برنامج تلفزيوني وصمة عار المطلوبة.
لا تسمح بيو فيلم إلى استنزاف أو الجافة لأكثر من بضع ثوان. تُضاف البقعة إلى الطبق. الكمية اللازمة من وصمة عار يعتمد على كتلة بيو فيلم.
ثم تعيين الطبق المغطى على خلاط مداري بطيء بين عشية وضحاها وحماية من الضوء مع احباط أو قطعة من الورق الأسود. باستخدام الملاقط، نقل بيو فيلم ملون ثابت من برنامج تلفزيوني إلى خمسة ملليلتر من 50/50 PBS-الميثانول في قارورة زجاجية 20 ملليلتر مع البيوفيلم التي تواجه ما يصل. خلط يدويا مع الحركة المدارية على فترات دقيقة واحدة لمدة خمس دقائق.
إزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات يجري الحذر لتجنب الاتصال بين ماصة وبيوفيلم أو بيو فيلم والقارورة. إعادة ملء بلطف مع ثلاثة ملليلتر من الميثانول أنيق. خلط يدويا مع الحركة المدارية على فترات دقيقة واحدة لمدة ثلاث دقائق.
الآن إزالة المذيبات إلى زجاجة نفايات وإعادة ملء على الفور مع خمسة ملليلتر من الميثانول. بعد خلط يدويا مع الحركة المدارية على فترات دقيقة واحدة لمدة خمس إلى 10 دقائق، وإزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات. إعادة ملء على الفور مع ثلاثة ملليلتر من الميثانول.
الأغشية الحيوية غالبا ما تبدو أكثر غموضا في هذه المرحلة من مظهرها الأولي. إزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات وإعادة ملء على الفور القارورة مع خمسة ملليلتر من 50/50 ميثانول-ميثيل الساليسيلات. خلط يدويا مع الحركة المدارية على فترات دقيقة واحدة لمدة خمس إلى 10 دقائق.
وينبغي أن يكون بيو فيلم شبه شفافة في هذا المذيبات المختلطة. بعد إزالة المذيبات إلى زجاجة نفايات ، قم بإعادة ملء القارورة بلطف مع ثلاثة ملليلترات من salicylate الميثيل أنيق. خلط يدويا مع الحركة المدارية على فترات دقيقة واحدة لمدة ثلاث دقائق.
كرر العملية مرة أخرى مع خمسة ملليلترات من salicylate الميثيل أنيق، وخلط يدويا على فترات دقيقة واحدة لمدة خمس إلى 10 دقائق. عند هذه النقطة، يجب أن يكون بيو فيلم شفافة. إزالة المذيبات إلى زجاجة النفايات وإعادة ملء على الفور القارورة مع ثلاثة ملليلتر من الساليسيلات الميثيل أنيق.
بيو فيلم المعالجة مستقرة في هذا المذيبات. إذا كان استخدام المجهر المقلوب، واستخدام طبق المذيبات واقية من أن لديه أسفل الغطاء وإعداد الفواصل لدعم العينة المقلوبة. هنا، الفواصل هي حلقات السيليكون 13 ملليمتر التي هي غارقة قبل في الساليسيلات الميثيل لمدة ساعة واحدة لتقليل الانجراف التركيز بسبب تورم.
لبيو فيلم على ساحة سيليكون الصف الطبي، عكس مربع ووضعها على مسافة في بركة من الساليسيلات الميثيل في الطبق. تأكد من تجنب أي فقاعات تحت العينة. جبل الطبق بحزم على خشبة المسرح من المجهر وجعل النفط مغمورة الاتصال مع الهدف.
ضبط كمية من الساليسيلات الميثيل في الطبق بحيث الغضروف المفصلي يحمل العينة بقوة إلى أسفل على المتباعد من التوتر السطحي. ضع قطرة من salicylate الميثيل على رأس substratum مربع مقلوب للحد من مبعثر الضوء من النهاية غير لامع. ثم غطي الطبق بطبق زجاجي للحد من التبخر.
انتظر عدة دقائق للعينة لتستقر على الفواصل قبل التصوير. الآن، قم بإجراء المجهر confocal لتصوير العينة كما هو موضح في بروتوكول النص. لمعالجة الصور، افتح ImageJ أو فيجي.
تحقق للتأكد من أن البرنامج لديه ذاكرة معينة كافية للبيانات التي سيتم معالجتها. تتطلب معالجة مجموعة بيانات 2 غيغابايت على الأقل ثمانية غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي المخصصة لعملية سلسة. افتح ملف صورة المستوى التسلسلي الذي سيتم معالجته.
إذا كان الكمبيوتر RAM غير كافية لمعالجة المكدس بأكمله substacks قد تتم معالجة ثم إعادة تجميعها في رصة واحدة. تحويل البيانات إلى تنسيق 32 بت لتمكين عائم نقطة العمليات الحسابية باستخدام قائمة الصورة، اكتب، 32 بت. سيؤدي هذا إلى مضاعفة حجم الملف.
طرح الخلفية السلس لزيادة التباين من الميزات في التركيز. معالجة المكدس بأكمله عن طريق التنقل إلى القائمة معالجة طرح الخلفية. ضبط نصف قطر الكرة المتداول إذا لزم الأمر.
يجب أن يكون نصف قطر الكرة أكبر بكثير من أكبر بُعد لخصائص التركيز البؤري التي سيتم الحفاظ عليها. لتعيين كافة البكسلات السالبة إلى صفر، أضف كل صورة إلى قيمتها المطلقة. أولاً، تكرار المكدس باستخدام قائمة الصور، مكررة، مكدس مكرر.
ثم تأخذ القيمة المطلقة للبيانات المكررة باستخدام القائمة العملية ، والرياضيات ، والقيمة المطلقة. إضافة اثنين من المكدسات عن طريق التنقل إلى القائمة عملية، آلة حاسبة الصورة، إضافة. لإعادة بشكل بديهي كومة الصورة ، واستخدام قائمة الصور ، والمكدسات ، والعيد.
ثم حدد تباعد الإخراج 1.0، ابدأ في الأعلى وتجنب الاستيفاء. محور التركيز هو الآن المحور العمودي في المكدس. يساوي البعد Y للكومة اُعيد عدد مستويات التركيز.
لجعل عرض عرض جانبي لبعض أو كل من المكدس، انتقل إلى قائمة الصورة، مكدسات، Z المشروع. تعيين شريحة البداية وشريحة التوقف لتشمل بعض أو كل من عرض الجانب الطائرات. حدد الحد الأقصى للكثافة للحصول على أفضل النتائج.
قم بتصحيح القياس المحوري لإسقاط العرض الجانبي عن طريق الانتقال إلى قائمة الصورة، المقياس. يجب تصحيح الإسقاط لبكسل مستوى الصورة غير المتكافئ وزيادة التركيز باستخدام عامل المقياس المحوري. تعيين مقياس X إلى واحد وتعيين مقياس Y إلى عامل مقياس محوري.
حدد الاستيفاء bicubic. حدد إنشاء نافذة جديدة. ضبط السطوع والتباين.
ثم قم بالتحويل إلى تنسيق ثمانية بت للعرض. بدلاً من ذلك، قم بتطبيق جدول بحث اللون وحفظه على أنه لون RGB أو ثمانية بت. باستخدام المذيبات غير القابلة للخطأ المتسلسل لزيادة معامل الانكسار، يمكن تقدير الحد الأقصى في الوضوح بسرعة.
يتم تكرير هذا من قبل المجهر التقليدية الطور النقيض للعثور على نقطة من التباين الأدنى. تم تبادل واحد بيو فيلم تسلسلي بين الزيلين ومجموعة ضيقة من السوائل المرجعية في هذا النطاق. بعد كل تبادل، تم نقل نفس الحقل وعرضه من خلال غطاء.
مع زيادة المؤشر، يتم رؤية عكس التباين لأول مرة عندما يساوي n 1.530 لرائط الخلية، تليها السيتوبلازم عندما n يساوي 1.535. يظهر هنا تصوير عميق من نوع متحولة والبرية C.albicans biofilms. نمت بيو فيلم نوع البرية إلى سمك 502 ميكرون كما رأينا في الإسقاط عرض الجانب من 538 كومة صورة confocal الطائرة.
وتبين الإسقاطات المحورية من القمة إلى القاعدة التباين في أنواع الخلايا والطبقات المختلفة من البيوفيلم. يوضح هذا المثال بنية نوع البرية المميزة. نمت بيو فيلم متحولة إلى سمك 500 ميكرون كما رأينا في الإسقاط عرض الجانب من كومة صورة الطائرة 556.
هذا متحولة معروفة للخضوع للنمو خيوطي في غياب الضغوطات المحفزة أنتجت بنية مختلفة بشكل كبير. كما رأينا في كل من عرض الجانب والإسقاطات المحورية، العديد من الخلايا المتفرعة تؤدي إلى نمو شعاعي. هذا هو مؤشر الانكسار عالية عميق بروتوكول التصوير.
من الناحية المثالية، يجب أن تتطابق مع مؤشر الانكسار للعينة ومؤشر الانكسار لزيت الغمر. هذا هو السبب في هذه الحالة، ونحن نستخدم هدف الغمر النفط. معظم دراساتنا كانت التصوير الهيكلي للأغشية الحيوية باستخدام علامات جدار الخلية، ولكن أي طريقة الفلوريسنس التي تستخدم مع العينات الثابتة يجب أن تعمل بما في ذلك immunofluorescence، fluorescence في التهجين الموقعي، والتعبير الجيني مراسل.
هذا الكائن الحي خاصة، المبيضات ألبيكانس، هو commensal في البشر الأصحاء، ولكن هو أيضا مسبب الأمراض الانتهازية التي يمكن أن تسبب التهابات الخميرة المخاطية أو النظامية. في بعض المؤسسات، يتطلب الأمر أساليب وبروتوكولات الاحتواء BSL II. بالإضافة إلى ذلك، فإن تثبيتات الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد متقلبة وخطرة.
وهي مواد مسرطنة معروفة. تشكل التخفيفات من المثبتات في غطاء الدخان. الاحتفاظ بالأطباق التي تحتوي على المثبتات المخففة المغطاة ولا تضع حاويات تحتوي على هذه المثبتات في خزانة السلامة الحيوية أو في حاضنة ثقافة الخلية.
