يصف هذا البروتوكول استراتيجية علاجية جديدة محتملة يمكن تعديلها بسهولة للتطبيقات البشرية. هذه التقنية يعزز مباشرة تحريض الخلايا T الأمعاء التوجيهية في الأنسجة اللمفاوية الطرفية ويمكن تنفيذها بشكل ثابت حتى في البيئات الموالية للالتهابات للغاية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنيات للتحقيق في دور نشط فيتامين (د) وفيتامين (أ) داخل الجهاز المناعي المحيطي.
هذا العرض التوضيحي البصرية سوف توفر خطوة بخطوة تعليمات لتوليد عالية الجودة هندسة الخلايا الجذعية التي تعتبر حاسمة لنجاح هذه التقنية. تبدأ بذر مرة واحدة 10 إلى الخلايا السبع 293T في 20 ملليلتر من CM-10-D خلية ثقافة المتوسطة في 150 من قبل 25 ملليمتر لوحات الثقافة لاحتضان 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، إضافة 1.62 ملليلتر من الطازجة أعدت حل HBS مركزة مزدوجة، 9.5 ميكروغرام من plasmid المغلف، 17.5 ميكروغرام من بلازميد التعبئة والتغليف، و 27 ميكروغرام من بلاتسي-CYP-ALDH plasmid إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
جلب الحجم النهائي للمحتويات أنبوب تصل إلى 3.0375 ملليلتر مع الماء تليها إضافة 202.5 ميكرولترات من اثنين من كلوريد الكالسيوم المولر قطرة. اترك خليط هطول الأمطار بالحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع الخلط العرضي قبل إضافة 3.24 ملليلتر من الحل المنسدل لكل ثقافة 293T أثناء تدوير الطبق بلطف. ضع اللوحات في الحاضنة لمدة 24 ساعة قبل غسل كل لوحة بلطف مع PBS وتغذية الخلايا بـ CM-4-D ثقافة متوسطة.
بعد 24 ساعة أخرى من الثقافة، حصاد supernatants في زجاجات معقمة لتخزينها في أربع إلى ثماني درجات مئوية وتغذية الخلايا مع متوسطة CM-4-D جديدة لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم الرابع، حصاد الماوس مرة أخرى والضغط على supernatants من كل يومين ثلاثة وأربعة إلى مرشح 0.45 ميكرومتر. ثم، تركيز فيروس سف-G pseudotyped عن طريق الطرد المركزي لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي يُعيدون المُتشردين السماح للأنبوب لاستنزاف على منشفة ورقية في مجلس الوزراء سلامة الحيوية العقيمة لعدة دقائق، ثم resuspend الكريات في 33.3 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة تحتوي على 5٪ الجلسرين لكل طبق الثقافة. لتوليد الخلايا التشعبة المشتقة من نخاع العظم، ضع الساق والعظم، الذي يتم حصاده من فئران BALB/c، في طبق ثقافة 100 في 20 ملليمتر يحتوي على ثقافة حديثة.
استخدام مقص تشريح ملقط لإزالة أي أنسجة من العظام. عندما يتم تنظيف جميع العظام، استخدم المقص لقطع طرفي كل عظمة لفضح تجاويف نخاع العظم. استخدام حقنة 10 ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 30 لطرد كل العظام مع 10 ملليلتر من المتوسطة ثقافة جديدة, جمع نخاع العظام في أنبوب 15 ملليلتر.
عندما تم جمع كل من نخاع العظام، رواسب نخاع العظام عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في مليلتر اثنين من خلايا الدم الحمراء العازلة. بعد أربع إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز في بعض الأحيان، ووقف رد الفعل مع 10 ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. resuspend بيليه في 10 ملليلتر من CM-10-R ثقافة المتوسطة لحساب وضبط الخلايا مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر من CM-10-R تركيز متوسط الثقافة.
بعد ذلك، إضافة 100 وحدة لكل ملليلتر من الغسالة المؤتلفة GM-CSF و 10 وحدات لكل ملليلتر من IL-4 إلى الخلايا. لوحة أربعة ملليلتر من الخلايا في آبار فردية من لوحة ثقافة ستة جيدا لاحتضانهم في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. في نهاية الحضانة ، تعرق بلطف الخلايا غير المنضمة.
إضافة المتوسطة الطازجة مع GM-CSF و IL-4 إلى الثقافات قبل إعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية لإضافة 48 ساعة. في نهاية الحضانة الثانية، حصاد الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم غير المنضمين إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر للطرد المركزي. لتوليد خلايا BMDC-CYP-ALDH، resuspend الثقافات في واحد مرات عشر إلى الخلايا التشعب السادسة لكل 500 ميكرولترات من CM-10-R المتوسطة لكل تركيز جيد، ولوحة 500 ميكرولترات من الخلايا في كل بئر من لوحة ثقافة 6 جيدة جديدة.
إضافة 50 ميكرولترات من فيروس LENTI-CYP-ALDH و 8 ميكروغرام لكل ملليلتر من البروتامين إلى كل بئر، ثم ضع اللوحة في الحاضنة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدل المُنَتَكّن بثقافةٍ جديدةٍ، ثمّ أعدّ اللوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة أخرى. في نهاية الحضانة الثانية، يمكن تنشيط الخلايا مع 100 نانوغرام لكل ملليلتر من الدهون السكريد في البئر لمدة 24 ساعة قبل الحصاد للتحليلات الوظيفية.
بالمقارنة مع الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام الوالدين، فإن خلايا BMDC-CYP-ALDH تعرض تعبيرًا معززًا من 1-ألفا-هيدروكسيلاس. تركيزات الشكل النشط من فيتامين (د) في تربية فائقة من BMDC-CYP و BMDC-CYP-ALDH الخلايا هي تقريبا 20 مرات أعلى من تلك التي لوحظت في النخاع العظمي الوالدين الخلايا المتسخة المشتقة و BMDC-ALDH الخلايا الثقافات. إن متوسط الكثافة الفلورية لخلايا BMDC-CYP-ALDH المعالجة بالركيزة أعلى بست مرات تقريبًا من الخلايا الزجرية المشتقة من نخاع العظم الأبوي المعالجة بالركيزة.
وهذا يشير إلى أن الخلايا BMDC-CYP-ALDH تعبر عن نشاط dehydehydrogenase-2 الأنزيمية المعززة بشكل كبير. DC2.4 الخلايا المعالجة مع 25-hydroxy فيتامين (د) والشبكية لا تحفز على تغيير كبير في وفرة من foxp3 إيجابية CCR9 إيجابية CD4 الخلايا T إيجابية. في المقابل، DC2.4 خلايا CYP-ALDH المعالجة بفيتامين د 25 هيدروكسي وشبكية العين تحفز أعداداً أكبر بكثير من الخلايا التائية التنظيمية الأمعاء بطريقة تعتمد على التركيز.
وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع خلايا التحكم حقن داخل الصفتون، DC CYP-ALDH الخلايا أيضا إحداث زيادة كبيرة في عدد من foxp3 إيجابية CCR9 إيجابية CD4 الخلايا T إيجابية بعد حقن داخل الصفاق في الحيوانات المتلقي BALB / ج. يعتمد نجاح الإجراء على إعداد خلايا T صحية وخليط حمض نووي معد بشكل صحيح.
