ويوفر البروتوكول طريقة سهلة المقبض ومتوافقة على نطاق واسع لأسلوب ثقافة الخلية الأولية لللافقاريات البحرية. هذه التقنية تعطي الباحثين وسيلة لثقافة الخلايا اللافقارية البحرية لفترة طويلة نسبيا. وينبغي تزويد ثقافة الخلايا بخلفية جينية متسقة من أجل استخدام تطبيقات تجريبية بيولوجية أخرى مختلفة في مجال بحوث البيولوجيا البحرية.
ونعتقد أن البروتوكول المبسط المشار إليه ينبغي أن يكون الخيار الجيد لممارسة البحث الجديد في هذا المجال. بعد التخدير، تشريح وجمع الأمعاء الأمامية، ثم قسم عينات الأنسجة عموديا وإزالة المحتويات الداخلية. غسل عينات الأنسجة في برنامج تلفزيوني مرتين وتطهيرها عن طريق الغمر في محلول الإيثانول 75٪ لمدة لا تزيد عن ثانيتين.
ثم غسل عينات الأنسجة في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لإزالة الإيثانول، ونقل حوالي 100 ملليغرام من عينة الأنسجة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير معقم ملليلتر. إضافة 1.5 ملليلتر من ثقافة ما قبل الأمثل المتوسطة إلى كتلة النسيج المعوي خيار البحر و mince كتلة مع مقص الجراحية المعقمة حتى الحل غائم. إضافة 400 ميكرولترات من 0.25٪ التربسين.
اخلطي الحل عن طريق الانعكاس وحضنيها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم تصفية الحل باستخدام مصفاة الخلية 100 ميكرون وجمع الترشيح في أنبوب جديد معقم اثنين ملليلتر أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. بالنسبة للبروتوكول الاختياري المبسط، يمكن نقل كتل الأنسجة المقطوعة في الوسائط المستزرعة مباشرة إلى أطباق ثم احتضانها.
الطرد المركزي الأنبوب في 1700xG لمدة ثلاث دقائق، والتخلص من الفائق، ثم إعادة تعليق بيليه في ثقافة المتوسطة مع المضادات الحيوية، وغسلها مع المتوسطة الثقافة مرتين. تعيين قبل الحاضنة لثقافة الخلية، وتشغيله مقدما لمدة 24 ساعة على الأقل مع درجة حرارة 18 درجة مئوية والرطوبة المشبعة. ثم إعادة تعليق الخلايا باستخدام 200 ميكرولتر من المتوسطة المشار إليها، ونقلها إلى أطباق أربعة سنتيمترات.
ثقافة الخلايا في الحاضنة. بعد ست ساعات، إخراجهم من الحاضنة وإضافة ملليلترين من الأطباق المتوسطة المشار إليها إلى أطباق زراعة الخلايا. كل 12 ساعة، تغيير نصف الوسط.
بعد خمسة إلى سبعة أيام، تبدأ الخلايا في الانقسام. الحد من الآثار السلبية للمضادات الحيوية عن طريق تقليل تركيز المضادات الحيوية المشار إليها، البنسلين، الستريبتومايسين، وgentamicin في الوسط ثقافة إلى النصف. كل يومين إلى ثلاثة أيام، استبدال متوسطة ثقافة الخلية.
عندما تصل كثافة الخلية الأساسية إلى 60٪ إجراء تمرير الخلية. أولاً، اغسل الخلايا المستزرعة مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة. إضافة 200 ميكرولترات من 0.25٪ تريبسين الحل إلى كل طبق، وتهيج يدويا الأطباق، وضمان تغطية القاع كله.
تخلص من محلول التربسين، وحضن الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع ملليلتر واحد من ثقافة جديدة المتوسطة عن طريق الأنابيب وإعادة تعليق الخلايا. نقل 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية إلى طبق جديد.
إضافة 1.5 ملليلتر من المتوسطة الطازجة، واحتضان الخلايا في 18 درجة مئوية. بعد 12 ساعة، قم بتغيير الوسط، ومراقبة الخلايا تحت المجهر لتقييم الظروف. إعداد ثلاث مجموعات تجريبية، بما في ذلك عنصر تحكم، ومجموعتين من الحلول، مع 1 ميكرومولار و 100 ميكرومولار deximethazone.
بعد الحضانة مع أو بدون deximethazone لمدة صفر، 24، أو 48 ساعة، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. بعد إيقاف الضوء، إضافة 300 ميكرولترات من حل hoechst 33258 في بئر إلى لوحة 12 جيدا، وتهيج بلطف لوحة لتغطية جميع الخلايا، وضمان تلطيخ بهم. احتضان في 18 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ثم إزالة حل تلطيخ hoechst وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 300 ميكرولترات من الحل أربعة في المئة شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لكل بئر. يُثار بلطف لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني.
الحفاظ على برنامج تلفزيوني بعد الغسيل الماضي للحفاظ على الخلايا المشمولة. قم بتشغيل أجهزة المجهر الفلورسنت، بما في ذلك طاقة مصباح الزئبق، وقوة الضوء الفلورية، والكمبيوتر الشخصي. قم بتسجيل الدخول إلى حساب نظام التشغيل، واطلّق البرنامج، وتحقق من تكوينه. ضع اللوحة المعدة على مرحلة المجهر.
ضع العينة فوق العدسة الهدف باستخدام وحدة تحكم المرحلة. العثور على الخلايا ذات الاهتمام تحت المجهر الخفيفة. قم بالتبديل المجهري الفلوري وضبط معلمات الإثارة والانبعاثات إلى حوالي 352 و461 نانومتر، على التوالي، لمراقبة الحمض النووي.
التقاط الصور. في هذه الدراسة، تم تأسيس ثقافة الخلايا المعوية الأولية من خيار البحر والمرور. تظهر خلايا مستديرة في مراحل مختلفة من الاستزراع هنا.
هنا الخلايا تعلق على الجزء السفلي من الأطباق في اليوم الثالث، بعد أن بذر. هنا انتشار الخلايا في اليوم السابع. وهنا الخلايا تعلق على الجزء السفلي من الأطباق بعد passaging.
والخلايا التي فقدت النشاط وكانت تموت بعد 10 ممرات. تقدم الأقوال التي تقدمها EDU أدلة مباشرة للكشف عن النشاط التكاثري لهذه الخلايا المستديرة في مراحل لاحقة. التحفيز مع واحد deximethazone micromolar زيادة معدل الخلايا المبرمج أسرع، مقارنة مع السيطرة و 100 ميكرومولار deximethazone التحفيز.
تم التعامل مع الخلايا المستزرعة مع deximethazone لفترات زمنية مختلفة ، تليها هويشست 33258 تلطيخ للكشف عن الخلايا المبرمج. علاجات الخلايا قبل احتضان أمر بالغ الأهمية للسيطرة على المدى الطويل. وهو تذكير لمحاولة البروتوكول الاختياري المبسط عندما لا تنمو الخلية بشكل جيد.
Paraformaldehyde هو معتدل السامة عن طريق ملامسة الجلد أو الاستنشاق، ويتم توثيقه على أنه ربما مسرطنة الإنسان.
