مستقبلات التجمع في كل مكان وغالبا ما تكون ضرورية للإشارة إلى التوازية التنشيط. ومع ذلك، هناك عدد قليل من الطرق المتاحة لقياس درجة التجمع. نحن نستخدم الانعكاس الداخلي الكلي، المجهر TIRF، لمتابعة انتشار جزيئات FGFR1-mEGFP في غشاء البلازما للخلايا الحية.
ثم نحن تطبيق سطوع عدد، وتحليل N & B، لوصف ديناميات مجمعات مستقبلات حفز. TIRF مثالية للتصوير الصدغي السريع للأحداث الجزيئية التي تحدث بالقرب من سطح الخلية، في حين أن N&B يحدد متوسط حالة القلة من جزيئات الفلورسنت على أساس انتشار داخل وخارج حجم الإضاءة من المجهر. في الواقع، هذا هو أداة لربط التنظيم الزماني المكاني للمستقبلات في سطح الخلية حيث أنها تشير.
تحتاج N&B فقط إلى الوصول إلى المجهر مع وحدة اقتناء سريعة. يمكنك تحليل مساحة كبيرة من الخلايا الحية وجود مجرد معرفة أساسية من أساليب التقلبات الفلورية. يمكن تطبيق هذه الطريقة على البروتينات التي تشكل الخافتات أو المجموعات ويمكن أن تكون ذات تسمية رصينة مع صبغة الفلورسنت.
إذا كانت البروتينات في مقصورات داخل الخلايا، يتم استخدام أنواع أخرى من المجاهر للحصول على الصور. من المهم إعداد بناء يعبر عن شكل أحادية اللون من الفلوروفور لقياس السطوع أحادية اللون النقية تحت الظروف التجريبية كتحكم. في اليوم الأول، بذور خلايا HeLa في 1.5 ملليلتر من المتوسط الكامل بتركيز من 100، 000 إلى 200، 000 خلية لكل ملليلتر في أطباق الزجاج القاع.
بذور ستة إلى ثمانية أطباق تكرار، واحتضان في حاضنة في 37 درجة مئوية. في اليوم الثاني أو الثالث، وصلت الخلايا إلى التوافق الفرعي. إضافة المصل خالية من المتوسطة مع البروتين plasmid إلى نصف الأطباق، وإضافة plasmids المرجعية مع مونومر وأدم إلى النصف الثاني من الأطباق إلى نقل الخلايا.
بعد يوم واحد ، تحقق من أن الخلايا المصابة بالعدوى هي التي تلتهم الجزء السفلي من الأطباق وغشاء الخلية هو الفلورسنت. تخلص من الأطباق مع الخلايا المتضخمة أو مع الفلورس المنخفض جدا. قبل أربع ساعات من التجربة، قم بتنشيط حاضنة درجة الحرارة للمجهر عند 37 درجة مئوية.
بدوره على المجهر، وأجهزة الكمبيوتر، والكاميرات، وانتظر الكاميرات للوصول إلى درجة حرارة العمل المناسبة من ناقص 75 درجة مئوية. وضع قطرة صغيرة من النفط على العدسة الهدف. وضع طبق عينة في حاضنة المجهر، وإغلاق أبواب الحاضنة للسماح لدرجة حرارة الطبق توازن لمدة 10 دقائق.
قم بتشغيل مصباح epifluorescence ويزر 488 نانومتر. حدد وضع تباين epifluorescence لاستكشاف العينة، والبحث خلية للتركيز من عدسة العين. حدد مرشح المناسبة لجمع الانبعاثات الخضراء من خلال الكاميرا المجهر مع شريط 490/20 500 و bandpass إم 525/50 أو ما شابه ذلك.
التبديل من العين إلى تقرير كام في وضع epifluorescence. قم بصقل التركيز، ثم قم بتغيير وضع TIRF. ثم قم بتنشيط المحاذاة التلقائية باتباع تعليمات مجهر TIRF.
اختيار عمق الإضاءة المناسبة، وتحسين اتجاه الحقل الواح. التبديل إلى كاميرا ثانية. تعريف منطقة ذات أهمية لا تقل عن 256 في 256 بكسل.
تعيين التعرض إلى ميلي ثانية واحدة وم م gain إلى 1,000. اضبط طاقة الليزر إلى 0.5 مللي واط. من الضروري الحصول على بعض المعلومات حول معامل انتشار البروتين لأن وقت التعرض يجب أن يكون أقصر من متوسط الوقت الذي تقضيه جزيئات الفلورسنت في الحجم المُحَمّم.
تشغيل تسلسل تجريبي الأول في ظل الظروف الأولية، وتقدير قيمة إشارة إلى ضوضاء تقريبًا. الشروط مقبولة في إشارة إلى ضوضاء يساوي 2-3 أو أعلى كما يقاس في سلسلة المرة الأولى. ثم استخدم شريط التمرير لنظام تقسيم الانبعاثات الذي يربط الكاميرا رقم اثنين بالمجهر لإخفاء جانب من الصورة.
حدد خيار الحفظ التلقائي لملف الكاميرا. ابدأ عملية الحصول على سلسلة الصور لما لا يقل عن 700 إطار بنسبة إشارة إلى ضوضاء أدنى من اثنين. دون أخذ الطبق من المجهر، إضافة ليغاند.
حدد خلية ذات غشاء مضيء، ثم ابدأ بسرعة السلسلة الأولى من الركض الحركي. البحث في الخلية الثانية ، والحصول على نقطة الوقت الثاني من الحركية. التقاط خلية جديدة لكل نقطة وقت من تشغيل الحركية.
لكل طبق جديد، كرر محاذاة خط الليزر وتحسين الإضاءة TIRF. الآن تحويل وحفظ ملفات الصور المكتسبة مع برنامج الكاميرا كملفات tif. استيراد ملفات tif في روتين برنامج التحليل عن طريق تنشيط المستخدم الرسومية N & B MATLAB.
تجاهل سلسلة التي يظهر متوسط كثافة الملف الشخصي أكثر من 10٪ photobleaching وسلسلة التي كان هناك تشويه غشاء الخلية واضحة أو الترجمة أثناء الاستحواذ. اقتصاص الإطارات التي من الواضح أن من التركيز. احتفظ للتحليل فقط مع سلسلة 500 الأطر الزمنية على الأقل.
أولا تحديد المعلمات الكاميرا. قم بتنشيط كاميرا المعايرة الروتينية. حدد مساحة لا تقل عن 20 في 50 بكسل في منطقة ضوضاء الكاشف.
في وتيرة السجل مقابل الرسم الرقمي، حرك المؤشر الأحمر الخطي لتحديد الغاوسي في الجزء الخطي من المنحنى. تنشيط المفتاح B. تطبيق الحد الأدنى من binning 2.2 للحد من تشتت البيانات وتوليد الرسم البياني B-I.
استخدم مؤشر مربع التكرار لفحص الرسم البياني B-I. حدد عائد استثمار مربع للتحليل، ثم قم بإنشاء خريطة B الخاصة بعائد الاستثمار المحدد. ثم احفظ ملف ASCII قيم B المقترنة التحديد.
استيراد ASCII في برنامج رسومات لحساب توزيع التردد من البيانات والحصول على متوسط B-قيمة زائد أو ناقص S.E.Apply معادلة إبسيلون لاشتقاق متوسط سطوع لكل خلية في كل نقطة وقت من تشغيل الحركية. تطبيع البيانات وفقا لمعادلة التطبيع، حيث B't هو متوسط B-القيمة تقاس في الوقت t بعد إضافة ليغاند وB'0 هو متوسط B-القيمة التي تقاس في الوقت ر يساوي صفر، وهو 10 إلى 20 ثانية بعد ليجوند additino. رسم متوسط السطوع العادي مقابل وقت الاستحواذ لبناء تشغيل الحركية.
في هذه الدراسة، تظهر هنا نتائج تمثيلية من خليتين HeLa اثنين في نفس الطبق تعبر عن mEGFP-FGR1 تم التقاطها في وقت صفر وسبعة، بعد إضافة 20 نانوغرام لكل ملليلتر من FGF2. مقارنة مع الانشاءات المرجعية، و GPI-mEGFP و GPI-mEGFP-mEGFP- mEGFP، يظهر تسلسل التحليل بأكمله متوسط كثافة السلسلة الزمنية. مؤامرة من جميع القيم B.
B-I الرسم البياني. B-خريطة من العائد على الاستثمار المختار. و الرسم البياني المرتبط بتوزيع B.
بعد التحفيز مع 20 نانوغرام لكل ملليلتر من FGF2، يدير الحركية التمثيلية التي تبين متوسط السطوع كدالة الزمن يصف عملية بطيئة من التملم التي تستمر لعدة دقائق في سطح الخلية. عندما حفزت مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من NCAM-Fc، يكشف التشكيل الجانبي الحركي التحولات السريعة وال دورية من المستقبلات في الخلائط القلوية، والتي تصل أيضا إلى قيم السطوع فوق أن من الديم. لوحظت قيمة متوسط تطبيع من ثلاثة بشكل متكرر.
من المهم تقليل المتغيرات الإضافية بسبب عدم وجود تقلبات جزيئية وتبييض. ويجب أن تكون الخلايا ملتصقة جيدا طبق القاع الزجاجي، وليس متضخمة، وليس مكدسة. إذا كنا مهتمين بالبروتين الذي ينتشر بشكل أسرع داخل المقصورات داخل الخلايا ، يمكننا تطبيق أوقات الصفر الأسرع واستخدام المسح الضوئي على المجاهر البؤرية أو متعددة الصور على الصورة داخل الخلية.
مع نهجنا ، ونحن تقليل الآثار الضارة للphotobleaching عندما نريد لاستكشاف ديناميات الأحداث مثل التمدن. هذه الأحداث السيطرة على مجموعة متنوعة من الردود الخلوية ويصعب جدا إثبات في الخلايا الحية مع تقنيات أخرى.
