تخلي تخلي عن تخليد البروتينات هو التكنولوجيا الناشئة في النظم والبيولوجيا الاصطناعية لإنتاج في المختبر من البروتينات. أنظمة تخليد البروتين خالية من الخلايا ليس لها جدار الخلية، وبالتالي لدينا الوصول المباشر إلى المستقلبات. في هذا البروتوكول، نقوم بتحديد القياسات المطلقة لـ 40 مستقلبات تدخل في استقلاب الكربون والطاقة المركزي، مما يسمح لنا بتوصيف الأيض الخالي من الخلايا.
البروتوكول يعتمد على الانبثاث المركبات مع الانيلين، والذي يسمح لفصل أفضل وارتفاع دقة الطيف الكتلي. بالإضافة إلى ذلك، نحن نستخدم المعايير الداخلية مع نظائرنا نسمي أنيلين، من أجل التحديد الكمي المطلق للاستقلابات. الأيض الموسومة coelute، الذي يلغي آثار قمع الحديد.
السماح بالتدين الكمي الدقيق للمركبات. العمل في غطاء محرك السيارة، والجمع بين 550 ميكرولترات من النيولين، مع 337.5 ميكرولترات من LC-MS من المياه الصف. و112.5 ميكرولترات من 12 حمض الهيدروكلوريك المولر في أنبوب الطرد المركزي.
دوامة جيدا، وتخزين محلول ال وأنيلين المولوس ستة في درجة الحرارة 4.5 و 4 درجات مئوية. لإعداد ستة مولكر الكربون 13 حل انيلين، في درجة الحموضة 4.5، والجمع بين 250 ملليغرام من الكربون-13 انيلين مع 132 ميكرولترات من الماء، و 44 ميكرولترات من 12 حمض الهيدروكلوريك المولر. دوامة جيدا، وتخزينها في أربع درجات مئوية.
لإعداد 200 ملليغرام لكل ملليلتر حل EDC، حل اثنين ملليغرام من EDC في 10 ميكرولترات من الماء لكل عينة أن تكون الموسومة. ودوامة جيدة. لإعداد العينات، وإخماد وتعجيل البروتينات في تفاعل تخليق البروتين خالية من الخلايا، عن طريق إضافة حجم متساو من الجليد البارد 100٪ الإيثانول إلى تفاعل تخليق خالية من الخلايا.
أجهزة الطرد المركزي العينة في 12، 000 مرة ز، لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل المُنَعِر من العينة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي. لتسمية العينة بمحلول انيلين كربوني-12، قم بنقل ستة ميكرولترات من العينة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي، وإحضار الحجم إلى 50 ميكرولترات مع الماء.
إضافة 5 ميكرولترات من 200 ملليغرام لكل مللي EDC الحل، مزيج من الكربون 12 حل الأنيلين جيدا، ونقل 5 ميكرولترات في أنبوب. دوامة رد الفعل مع اهتزاز لطيف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعتين، قم بإزالة الأنابيب من الشاكر ونقلها إلى غطاء أبخرة.
إضافة 1.5 ميكرولترات من ثلاثية اليثيلامين إلى كل رد فعل لوقف رد فعل وضع علامات الانيسين وتثبيت المركبات. أجهزة الطرد المركزي في 13،500 مرات ز لمدة ثلاث دقائق. وأنقذ المُندفع.
لتسمية المعايير الداخلية بمحلول انيلين من الكربون-13، قم بتخفيف محلول المخزون الداخلي إلى 80 ميكرومولار بحجم نهائي من 50 ميكرولترات. إضافة خمسة ميكرولترات من 200 ملليغرام في حل EDC ملليلتر، وخمسة ميكرولترات من محلول النيلين الكربون مختلطة جيدا-13. دوامة رد الفعل مع اهتزاز لطيف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد ساعتين ، قم بإزالة الأنابيب من الشاكر ، وأضف 1.5 ميكرولترات ثلاثية الإيثيلامين إلى التفاعل في غطاء الدخان. جهاز طرد مركزي في 13،500 مرات ز لمدة ثلاث دقائق وحفظ الفائق. إلى الإلهية القياسية الداخلية الموسومة، وعينة الموسومة، مزيج 25 ميكرولترات من كل في قارورة autosampler.
وتحليل بواسطة الإجراء LC-MS. ثم، لإنشاء منحنى قياسي لالاستقلابات غير الموسومة، أولا، تمييع محلول المخزون من المستقلبات غير الموسومة إلى تركيزات مختلفة، مع حجم 50 ميكرولترات. إضافة خمسة ميكرولترات من 200 ملليغرام في حل EDC ملليلتر، وخمسة ميكرولترات من حل النيلين الكربون-12 لكل تركيز.
دوامة رد الفعل مع اهتزاز لطيف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. والمضي قدما في علاج ثلاثي الإيثيلامين. والطرد المركزي قبل تحليل من قبل LC-MS كما كان سابقا.
بعد تهيئة LC-MS ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وحقن خمسة ميكرولترات من العينة في العمود. والحصول على مناسبة م على ض أيونات كثافة للكربون-12 aniline الموسومة العينة. ثم، حقن خمسة ميكرولترات من نفس العينة مرة أخرى.
والحصول على درجة m على زد أيونات للمعايير الموسومة الكربون-13 aniline. في هذا البروتوكول، تم تحديد كمية الأيض التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في تخليق البروتين الخالي من الخلايا القائم على الإشريكية القولونية. تم الكشف عن 40 من نواتج الأيض التي تدخل في عملية التمثيل الغذائي المركزي للكربون والطاقة، وتم تحديدها كميا باستخدام معايير داخلية.
في حين تم تطوير منحنى قياسي لخمسة من الأيض التي لم تكن الموسومة مع aniline. وكانت الأيضات المتنوعة المشاركة في هذه المسارات فئة من السكريات الفوسفورية، والأحماض الفسفو الكربوكسيلية، والأحماض الكربوكسيلية، والنيوكليوتيدات، والعوامل المشتركة. وبالإضافة إلى ذلك، مكنت الطريقة فصل أزواج الايزومر الهيكلية، مثل فوسفات الجلوكوز-ستة، والفوسفات من الفركتوز-ستة في تشغيل واحد LC-MS.
الخطوة الأكثر أهمية هي وضع علامة على عينة دي البروتين مع انيلين. وبما أن حل الـ aniline ينفصل، فمن المهم العمل بسرعة وفعالية، مع الحفاظ على ممارسات السلامة الجيدة. هذه الطريقة تساعد على وصف الأيض خالية من الخلايا مع تحديد كمي من 40 المستقلبات.
ولكن، مركبات إضافية في الخليط خالية من الخلايا، مثل الأحماض الأمينية التي يمكن تحديد كميا. وهذا من شأنه أن يساعد في توفير نظرة أكثر شمولا في التمثيل الغذائي خالية من الخلايا. وكشفت هذه الطريقة أن الأنظمة الخالية من الخلايا لها عمليات استقلاب معقدة، لا تزال تعمل ويمكن استغلالها لتحسين كفاءة الطاقة وغلة الكربون.
ويعتمد البروتوكول على وضع علامات على المركبات باستخدام الـ ANILINE باستخدام EDC كمحفز. كل من هذه الكواشف خطرة وينبغي استخدامها بحذر.
