الدق الإلكترونية لأن الضامة تتخصص في الكشف عن جزيئات من أصل غير ذاتي ، فهي من الصعب بشكل خاص transfect. نحن نصف بروتوكول الذي يسمح نقل فعالة للغاية من الضامة الأولية مع مرنا ولدت من قوالب الحمض النووي مثل plasmids. والميزة الرئيسية لطريقتنا هي أن يتم تحقيق معدلات عالية من الحمل في غياب أي سمية للخلايا يمكن اكتشافها أو المناعي.
إثبات الإجراء سيكون مارك هيرب ما بعددوك من مختبري. تبدأ عن طريق ذوبان جميع مكونات عدة النسخ RNA. دوامة الكواشف لمدة خمس ثوان وتدور عليها لمدة ثانيتين في 2،000 مرات ز، ثم الاحتفاظ بها على الجليد حتى استخدامها.
إعداد رد فعل النسخ في المختبر RNA في أنبوب microcentuge 0.5 ميكرولتر وفقا لاتجاهات المخطوطة. دوامة الأنبوب وتدور عليه. ثم احتضانه في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حين خلط في 400 دورة في الدقيقة على خلاط الحرارية.
بعد الحضانة ، إضافة اثنين من microliters من DNase أنا مباشرة في مزيج رد الفعل. دوامة وتدور أنبوب أسفل، واحتضان ذلك في خلاط الحرارية لمدة 15 دقيقة أخرى. حجز aliquot اثنين ميكرولتر من المنتج Dnase المعالجة لجل التحكم وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.
لتعقيد بوليا، إضافة خمسة ميكرولترات من 10X بوليولا البوليميراز العازلة التفاعل وخمسة microliters من البوليميراز البولي إلى رد فعل Dnase المعالجة. دوامة وتدور أسفل هذا المزيج. ثم احتضانه في خلاط الحرارية لمدة 30 دقيقة.
عندما يكون رد الفعل كاملاً، خذ شهادتين ميكرولتر لجل التحكم واخزنه عند درجة حرارة 80 درجة مئوية. أضف 5-prime dephosphorylation الكواشف مباشرة إلى المنتج الذيل بوليا وفقا لاتجاهات المخطوطة. دوامة وتدور أسفل الأنبوب، واحتضان ذلك في خلاط الحرارية لمدة 30 دقيقة أخرى.
اتبع رد فعل dephosphorylation مع حضانة لمدة دقيقتين في 80 درجة مئوية من أجل تسخين phosphatase القطب الجنوبي. ثم تنقية في المختبر نسخ مرنا باستخدام طقم تنقية الحمض النووي الريبي مخصص. قياس تركيز ونقاء مرنا مائل مع مطياف microvolume.
تشغيل هلام agarose denaturing مع aliquots التي تم جمعها سابقا للتحقق من وجود منتج واحد، وطول نسخة صحيحة، ومخلفات بوليا. الاستعداد لtransfection عن طريق إضافة حجم محسوبة مسبقا من المخزن المؤقت مرنا transfection ناقص وحدات التخزين من مُكشف مرنا المُنْوَلِب و الميرنا إلى أنبوب رد فعل. اذيب مخزون الـ MRNA وخلطه بلطف عن طريق التقليب الأنبوبي.
ثم أضف حجم مرنا المحسوب مسبقاً إلى أنبوب التفاعل. دوامة وتدور أسفل مزيج التفاعل ومحول مرنا، ثم إضافة الحجم المناسب من مبيد الانفعال مرنا إلى أنبوب مزيج التفاعل. دوامة الأنبوب وتدور عليه.
ثم احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه، استبدال الوسط ثقافة من الضامة مع ثقافة دافئة جديدة المتوسطة. بمجرد اكتمال حضانة مزيج transfection ، أضف المزيج إلى آبار الصفيح التي تحتوي على الزبنة المنسدلة وفي دائرة من الخارج إلى منتصف البئر.
لضمان التوزيع الموحد لمزيج transfection صخرة بلطف لوحة في اتجاه عمودي وأفقي. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات على الأقل. بعد الحضانة، وتحليل كفاءة transfection مع المجهر الفلوريسنس، تدفق استئصال الدراجات أو مناعي.
أهم جزء من هذا الإجراء هو ضمان التوزيع الموحد لمزيج transfection بحيث تحصل على جميع الضامة في اتصال مع نفس الكمية من مرنا. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لإنشاء ترميز MRNA لـ FLAG-TAGGED NEMO و IKK-beta المتغيرات لtransfection من الضامة الأولية. تم التحقق من الحجم الصحيح ومخلفات البوليا من مرنا بواسطة agarose هلام الكهرباء.
تم تأكيد كفاءة النقل عن طريق توليد مرنا ترميز GFP وإجراء تحليل تدفق cytometry. وارتفع معدل العدوى إلى جانب كمية مرناً المتحولة، حيث وصل إلى 50 إلى 65٪ لPM و80 إلى 85٪ لـ BMDM. في كل من PM و BMDM، ارتفع مستوى التعبير من EGFP في الخلايا المصابة في الوقت وبطريقة تعتمد على الجرعة.
الأهم من ذلك، أكد تحليل اللوودينيوم إيوديميد إيجابية أو الملحق الخامس-الضامة الإيجابية أن الإجراء transfection لم تحفز موت الخلايا اللوائية أو المبرمج. تم تحليل كفاءة نقل mRNAs ترميز الأعلام الموسومة نيمو أو IKK بيتا المتغيرات مع المجهر immunofluorescence. وكانت المعدلات حوالي 60٪ بالنسبة لـ Nemo mRNAs و 55٪ لـ IKK-beta mRNAs.
كما تم استخدام هذا البروتوكول لتوليد مرنا ترميز Cre إعادة الكومبيناسي. نقل 400،000 BMDM مع 400 نانوغرام من مرنا إعادة الكومبينيز Cre أدى إلى استنفاد كامل تقريبا من البروتين نيمو بعد 48 ساعة، مما يدل على نقل كفاءة عالية. عدم وجود أي كميات يمكن الكشف عنها من Interleukin 1 بيتا, Interleukin-6 وعامل نخر الورم تشير إلى أن إجراء transfection لا تنشيط الإشارات المضادة للالتهابات.
يسمح أسلوبنا البسيط نسبيًا أخيرًا بالتعبير عن البروتينات المتحولة أو الموسومة بكفاءة في الضامة الأولية. وهذا من شأنه أن يزيد إلى حد كبير من تحليل وظائف الضامة على المستوى الجزيئي.
