أيونات الحركة الكتلة الطيفية، أو IM-MS، تحديد أيونات المنتجات المختلفة من الأكسدة الحمراء المعتمدة على درجة الH وميثيل ملزمة تفاعل الببتيدات. مع النمذجة الجزيئية لهيكلها الثالثي ، يمكن تحديد ارتباط المعادن. يمكن IM-MS حل كل من أيونات المنتج وتحديد تكوينها الجزيئي من خلال قياس وقت واحد من كتلة إلى الشحنة والوصول وفيما يتعلق قياس stoichiometry، حالة البروتون، وهيكلها التشكل.
وسوف تساعد تطوير فئات من الببتيدات المعدنية التهيج تؤدي إلى علاجات للأمراض المرتبطة باختلال التوازن الأيوني المعدني، مثل مينكيس ومرض ويلسون، والسرطان، ومرض الزهايمر. للبدء، تنظيف أنابيب مدخل ESI وعشوطة إبرة تماما مع حوالي 500 ميكرولترات من 0.1 حمض الخليك الجليدية الضرس، 0.1 الولي الأمونيوم هيدروكسيد، وأخيرا، المياه ديونيد. استخدام شروط ESI-IM-MS الأصلي كما هو موضح في بروتوكول النص لجمع أطياف IM-MS الإيونات السالبة والإيجابية من حل poly-DL-ألانين 10 جزء في المليون لمدة 10 دقائق لكل من هذه الدقائق.
Pipette 200.0 ميكرولترات من 0.125 ميليمولار البديل الميثانول، أو حل amb، في 1.7 قنينة ملليلتر. تمييع مع 500 ميكرولترات من المياه ديوند وخلط الحل جيدا. ضبط درجة الحموضة من العينة إلى 3.0 بإضافة 50 ميكرولترات من 1.0 حمض الخلية المولية حل.
أضف 200.0 ميكرولترات من أيونات المعادن 0.125 ملليمولر إلى العينة المعدلة حسب مستوى الـ PH. ثم، إضافة المياه deionized إلى إنتاج حجم النهائي من 1.00 ملليلتر من العينة. تخلط جيدا، والسماح للعينة لتكواسير لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
باستخدام حقنة الأنف حادة، واتخاذ 500 ميكرولترات من العينة وجمع السلبية والإيجابية ESI-IM-MS أطياف لمدة خمس دقائق لكل من. استخدم الـ 500 ميكرولترات المتبقية للعينة لتسجيل الرقم القياسي النهائي باستخدام أقطاب قياس الرقم الـ 4 الدقيقة معايرة. كرر هذه الخطوات، باستثناء لضبط الأس هيدروك مع أربعة، خمسة، ستة، سبعة، ثمانية، تسعة، أو 10، عن طريق إضافة كميات جديدة من حمض الخليك أو محلول هيدروكسيد الأمونيوم.
جمع السلبية والإيون ESI-IM-MS أطياف الحلول الناتجة لمدة 10 دقائق لكل من. من أطياف IM-MS، تحديد الأنواع المشحونة من الميثانول البديل الموجودة من خلال مطابقتها لأنماط نظائرها النظرية من الكتلة إلى الشحنة. للقيام بذلك، افتح MassLynx وانقر على الكروماتوجرام لفتح إطار الكروم.
انتقل إلى القائمة ملف وفتح لتحديد موقع وفتح ملف البيانات IM-MS. استخراج الطيف IM-MS بالنقر بزر الماوس الأيمن، وسحب عبر الكروماتوغرام، والإفراج. سيتم فتح نافذة الطيف، والتي تظهر طيف IM-MS.
في نافذة الطيف، انقر على الأدوات ونموذج النظائر. في نافذة نميم النظائر، أدخل الصيغة الجزيئية لأنواع amb، وتحقق من مربع إظهار الأيونات المشحونة، وأدخل حالة الشحن. انقر فوق موافق. كرر هذه العملية لتحديد جميع الأنواع في طيف IM-MS، وتسجيل نطاق النظائر الشامل إلى الشحن.
لكل نوع من أنواع الـ amb، قم بفصل أي نوع من الأنواع من قبيل الصدفة من الشامل إلى الشحن واستخرج توزيعات وقت الوصول، أو ATDs، باستخدام أنماط النظائر الشاملة إلى الشحن لتحديدها. افتح DriftScope وانقر على ملف وفتح لتحديد موقع وفتح ملف البيانات IM-MS. استخدام الماوس وانقر على اليسار لتكبير على نمط نظائر الشامل إلى تهمة من الأنواع amb.
استخدم أداة التحديد وزر الماوس الأيسر لتحديد نمط النظائر. انقر فوق الزر قبول التحديد الحالي. لفصل أي الأنواع من قبيل الصدفة الشامل إلى تهمة، استخدم أداة الاختيار وزر الماوس الأيسر لتحديد وقت ATD الانحياز مع نمط النظائر من الأنواع amb.
انقر فوق الزر قبول التحديد الحالي. لتصدير ATD، انتقل إلى ملف، تصدير إلى MassLynx. ثم حدد الاحتفاظ بوقت الانجراف وحفظ الملف إلى المجلد المناسب.
في إطار الكروماتوغرافيا MassLynx، افتح الملف الذي تم تصديره. انقر على عملية ، دمج من القائمة ، والتحقق من ApexTrack الذروة التكامل مربع ، وانقر فوق موافق. سجل المركزية والمنطقة المتكاملة من ATD. بعد تكرار هذه العملية لجميع حفظ amb وبولي دل ألانين IM-MS ملفات البيانات، واستخدام ATD متكاملة لجميع أنواع amb المستخرجة إما الإيجابية أو الأيونات السالبة في كل نقطة المعايرة لتطبيع إلى مقياس النسبة المئوية النسبية.
للقيام بذلك، أدخل هويات الأنواع amb و ATD المتكاملة الخاصة بها في كل رقم هـي في جدول بيانات. لكل درجة من السّكّر، استخدم مجموع الـ ATDات المتكاملة لتطبيع أنواع الـ AMB إلى مقياس النسبة المئوية. رسم كثافة في المئة من كل الأنواع amb مقابل درجة الH لإظهار كيف يختلف عدد السكان من كل نوع كدالة من درجة اله pH.
باستخدام جدول بيانات، تحويل المقاطع العرضية الاصطدام من متعدد DL ألانين الأيونات السالبة والإيجابية تقاس في غاز عازلة الهيليوم إلى أقسام عرضية الاصطدام تصحيحها. ثم، تحويل متوسط أوقات الوصول من كاليبرانت بولي-DL-ألانين وأنواع المومب إلى أوقات الانجراف. سد مرات poly-DL-ألانين calibrants'الانجراف مقابل المقاطع العرضية الاصطدام تصحيحها.
ثم، باستخدام أقل المربعات تناسب الانحدار، وتحديد القيم الرئيسية وB، حيث هو رئيس هو التصحيح لدرجة الحرارة، والضغط، ومعلمات المجال الكهربائي، و B يعوض عن تأثير غير الخطي لجهاز IM. باستخدام هذه القيم رئيس الوزراء وB مع قيمة مرات الانجراف المركزية، وتحديد المقاطع العرضية الاصطدام تصحيحها والأقسام العرضية تصادم بهم. هذه الطريقة توفر الاقسام العرضية اصطدام لأنواع الببتيد مع أخطاء مطلقة تقدر بنحو 2٪ باستخدام غاوسي مع غاوسفيو، ومستوى B3LYP LanL2DZ من النظرية، وتحديد موقع هندسة الأمثل المطابقة لجميع أنواع ممكنة من التنسيقات من الأنواع amb الشامل إلى تهمة لوحظ.
ويتألف مستوى B3LYP LanL2DZ من النظرية من بيك ثلاثة محيط وظائف الهجين، ومجموعة الأساس Dunning، وإمكانات الأساسية الإلكترون. استخراج التحليلات الحرارية لكل من المطابقة الأمثل من ملف الإخراج غاوسي وحساب المقاطع العرضية الاصطدام النظرية باستخدام طريقة لينارد جونز تحجيم أيون من برنامج سيغما. من أدنى المطابقة للطاقة الحرة، وتحديد المطابقة التي يعرض لينارد جونز الاصطدام المقطع العرضي الذي يتفق مع المقطع العرضي تصادم IM-MS قياس.
وتحدد هذه العملية الهيكل الثالثي ونوع التنسيق للمواتير التي لوحظت في التجربة. النمذجة الجزيئية يتطلب مقارنة الطاقة الحرة والاصطدام المقاطع العرضية من المطابقة مع مختلف مواقع chelating المعدنية، رابطة الدول المستقلة والسندات عبر الببتيد، والجسور الملح، والترابط الهيدروجين، والتفاعلات بي الموجبة. وأظهرت دراسة IM-MS للميثانول البديلة واحدة أنه استخرجت كل من النحاس والزنك أيونات بطريقة تعتمد على درجة الH، ولكن من خلال آليات رد فعل مختلفة ومواقع التنسيق.
ولوحظ ربط الزنك (II) عند درجة هيدروكية أكبر من ستة، مما يشكل في المقام الأول مركباً واحداً مشحوناً سلباً، مما يشير إلى أن الزنك (II) كان بتنسيق رباعي الهيدرِلي من قبل الإيميدازولات واثنين من الثّيولات. النحاس (II) وكان مصحوبا بربط thiols تشكيل جسر كبريتيد. في درجة الأسكية أكبر من ستة، تم تشكيل النحاس واحد اتهم سلبا (II) مجمع، مما يدل على imidazole واثنين من النيتروجين أميد deprotonated كانت تنسق النحاس (II)ومع ذلك، أقل من درجة الH ستة، مضيفا النحاس (II) شكلت أيضا النحاس (I) واحد مشحونة إيجابية(I)المعقدة، فضلا عن النحاس واحد مشحونة إيجابية (II) مجمع فوق درجة اله.
كما تظهر دراسات IM-MS لـ amb two و amb 4 أن التفاعلات النحاسية أعطت منتجات تختلف في أعداد جسور ثنائي الكبريتيد بين أو داخل الجزيئات، وعدد من النحاس (I) أو النحاس (II) أيونات، وعدد مواقع إزالة البروتون، والتي تغيرت كدالة للرقم الهئيني. وأظهرت نتيجة IM-MS مع النمذجة الجزيئية أن الميثانول البديل يمكن تنسيق ما يصل إلى ثلاثة نحاس (I) أيونات عبر ثيولاتي، إيميدازوليس، ومجموعات الكربوكسيلات. يجب اختيار إعدادات IM-MS الفعالة بعناية للحفاظ على قياس الببتيدات، وتوزيعات الشحن، والهياكل التكتكية، كما هو موضح في النص.
مزيج من مجموعة أوسع من الحجم التي سوف تؤثر على التنسيق المعادن مثل التيروزين في حمض الأسبارتيك سوف تسمح بفهم أكبر للعلاقة بين الهيكل والوظيفة. IM-MS مع النمذجة الجزيئية أصبحت تقنيات بديلة لتسريع علم البلورات و NMR الطيفي لتحديد الهياكل التشكلية من البروتينات والحمض النووي والدهون، ومجمعاتها.
