من الصعب استخدام مرحلة العدوى المضيفة من T.cruzi في التجارب لأن amastigote هو طفيلي داخل الخلايا الملزمة. يسمح أسلوب الاستزراع لدينا للماستيكوت بالتكرار المؤقت خارج الخلية المضيفة ، حتى نتمكن من إجراء تجارب مباشرة على هذه المرحلة ذات الصلة سريريًا من الطفيلي. وسوف يكون إثبات الإجراء يوكي أكوتسو، وهو فني من معهدنا.
الحفاظ على ثقافة مُضيفة للطفليين وفقًا لاتجاهات المخطوطة. عندما يكون الطفيلي الذي يعبر عن Cas9 جاهزًا للتمايز ، اجمع المافق في أنبوب مخروطي ، وتحقق من جودة العينة تحت المجهر. إذا كان هناك عدد كبير من amastigotes خارج الخلية، تنفيذ إجراء السباحة خارج لعزل trypomastigotes.
تدور أسفل خليط من تريبوماستيغوست وmamastigotes لمدة خمس عشرة دقيقة كما 2، 100 مرة G.ثم تجاهل معظم supernatant، وترك 0.5 إلى 1 ملليلتر من المتوسطة في الأنبوب. فضفاضة غطاء الأنبوب، واحتضان بيليه في 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين، والتي سوف تسمح ل trypomastigotes النشطة للسباحة من بيليه. بعد الحضانة، نقل سوبرناتور مع trypomastigotes إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.
تدور عليه، وإعادة تعليق بيليه مع 5 ملليلتر من DMEM. نقل الطفيلي إلى قارورة ثقافة T-25 ، واحتضان القارورة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية تحت 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة. سيتمايز حوالي 95٪ من الطفيليات إلى amastigotes بعد 24 ساعة.
جهاز طرد مركزي ثقافة amastigotes خارج الخلية لمدة 15 دقيقة في 2، 100 مرة G، والتخلص من الفائق. resuspend بيليه مع العازلة الكهربائية التي تحتوي على ملحق حل إلى كثافة الخلية النهائية من 10 مرات إلى الخلايا 8 في المليلتر. Aliquot 100 ميكرولترات من الطفيليات resuspended في 1.5 لتر microcentrifuge الأنابيب.
ثم إضافة خمسة إلى 10 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي دليل، ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب. نقل الخليط إلى 2 ملليمتر فجوة الكهربائية cuvette، وتطبيق نبض مع جهاز الكهربائي. ثم، نقل محتويات cuvette في قارورة T-25، التي تحتوي على خمسة ملليلترات من متوسطة LIT مسبقًا، اترك الغطاء فضفاضًا، واحتضان القارورة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
مراقبة نمو الخلية إما عن طريق استمرار زراعة أكسل أو كما amastigotes داخل الخلايا بعد عدوى الخلية المضيفة. إذا رصد نمو الخلية كما amastigotes axenic، يهز بلطف قارورة لإعادة تعليق amastigotes خارج الخلية في الحل، ومزيج 20 ميكرولترات من الثقافة مع ميكرولتر واحد من محلول يوديد بروبديسيوم في أنبوب microcentrifuge. من المهم عدم ترك قارورة الثقافة خارج الحاضنة لفترة أطول من اللازم لأن درجة الحرارة هي واحدة من العوامل التي تمكن من انتشار الفأس من amastigote.
تطبيق العينة على قياس الهيموسيت، ومراقبته تحت المجهر الفلوري. ثم عد عدد amastigotes قابلة للحياة التي لا تلطخها مادة اليوديد بروبديسيوم. لمراقبة نمو خلايا خروج المغلوب كما amastigotes داخل الخلايا, البذور تستضيف الخلايا 3T3 في لوحة 12-well مع DMEM.
بعد يوم واحد من الكهربائي جمع amastigotes خروج المغلوب عن طريق الطرد المركزي، والتخلص من supernatant، وإعادة تعليق الطفيليات مع ملليلتر اثنين من DMEM. إزالة الوسيطة من ثقافة الخلية المضيفة وإضافة amastigotes resuspended. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين، والتي سوف تسمح amastigotes لإنشاء عدوى.
بعد اليومين، وغسل بعيدا amastigotes خارج الخلية خارج الخلايا المضيف مع DMEM، وإضافة DMEM الطازجة. مواصلة الحضانة لمدة يومين إضافيين، ومن ثم تصور نواة الخلايا المضيفة وmamastigotes داخل الخلايا. وقد ثبت أن T.Cruzi amastigotes المصابة مع دليل الجيش الملكي النيبالي ضد الجين الأساسي TCCGM1 تظهر عيب كبير في النمو مقارنة مع مجموعة التحكم.
عند رصد النمو كعضوس داخل الخلايا، فإن جزء النوى المضيفة المرتبطة نوى T.Cruzi أقل بكثير في مجموعة الضربة القاضية TcCGM1 مقارنة بالسيطرة. على العكس من ذلك، transfection من رنا دليل ضد واحد من بروتينات قضيب paraflagellar TcPAR1 لا يؤثر بشكل كبير على نمو الخلايا بعد أربعة أيام من زراعة أكسين أو تمنع نمو amastigotes داخل الخلايا. ومع ذلك ، خمسة أيام بعد العدوى ، وعدد من trypomastigotes التي تخرج من الخلية المضيفة هو أقل بكثير في TcPAR1 خروج المغلوب المشتركة الثقافة مقارنة مع السيطرة المشتركة الثقافة.
وعلاوة على ذلك، بدا أن التجربات المختلفة داخل الخلية المضيفة في مجموعة التحكم أكثر نشاطاً من تلك الموجودة في مجموعة خروج المغلوب. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة آثار الجينات الخارجية على مرحلة amastigote بدلا من RNA دليل transfecting في amastigote كاس9 التعبير عن, يمكنك نقل البلازميد في amastigote من نوع البرية للتعبير عن الجينات الخارجية.
