الصفائح الدموية يجب أن تكون خالية من خلايا الدم والبروتينات عند دراسة خصائصها الكيميائية الحيوية والفسيولوجية. لذلك، قمنا بتطوير بروتوكول لتنقية الصفائح الدموية من دم الماوس. يمكن لهذه التقنية تنقية الصفائح الدموية باستخدام iohexol التدرج المتوسطة والسرعة المنخفضة الطرد المركزي، مما أدى إلى فصل واضح من الصفائح الدموية من مكونات الدم الأخرى.
لتنقية الصفائح الدموية، استخدم طرف ماصات واسع الآبار لطبقة 200 ميكرولترات من الدم الكامل الطازج الذي تم حصاده ببطء على جانب أنبوب 1.5 ملليلتر على 600 ميكرولترات من المتوسط التدرج iohexol دون خلط. بعد الطرد المركزي في الدوار دلو يتأرجح لعزل الصفائح الدموية، واستخدام طرف جديد الماصات واسعة تتحمل لجمع معظم طبقة غنية بالصفائح الدموية وجزء صغير من طبقة الصفائح الدموية الفقيرة دون التعرق خلية الدم البيضاء أو طبقة خلايا الدم الحمراء. إضافة عينة الصفائح الدموية إلى أنبوب جديد، وإضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني إلى الصفائح الدموية.
اخلطي الصفائح الدموية عن طريق الانعكاس قبل إجراء طرد مركزي آخر. ثم resuspend بيليه في 200 microliters من برنامج تلفزيوني مع الأنابيب خفيفة. لتنشيط الصفائح الدموية، نقل واحد إلى مرتين 10 إلى الصفائح الدموية الستة إلى أنبوب جديد يحتوي على 100 ميكرولترات من عازلة تلطيخ.
إضافة واحد إلى اثنين من مرات 10 إلى الصفائح الدموية الستة إلى أنبوب مختلف يحتوي على 100 ميكرولترات من البقع العازلة تكملها 0.4 ملم ببتيد GPRP. إضافة ثرومبين إلى الأنبوب مع الببتيد GPRP لتنشيط الصفائح الدموية، وإضافة كوكتيل الأجسام المضادة من الفائدة لكلا الأنابيب. كتحكم إيجابي، إضافة ميكرولتر واحد من الدم كله في ما يصل إلى 100 ميكرولترات من عازلة تلطيخ في أنبوب يحتوي على 0.4 ملليمولار GPRP ببتيد، وإضافة ثرومبين لتنشيط هذه الصفائح الدموية.
كتحكم سلبي، إضافة ميكرولتر واحد من الدم كله في ما يصل إلى 100 ميكرولترات من عازلة تلطيخ. ثم وصمة عار كل من أنابيب التحكم مع كوكتيل الأجسام المضادة. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وغسل العينات مع ملليلتر واحد من عازلة تلطيخ جديدة لكل أنبوب.
Resuspend الكريات في 300 ميكرولترات من عازلة تلطيخ جديدة. ثم نقل عينات الخلية إلى تدفق الفردية أنابيب تحليل القياس الخلوي المحمية من الضوء. لتحليل الصفائح الدموية بواسطة قياس تدفق السيتومات، قم بإنشاء تجربة جديدة، وإنشاء مبعثر لوغاريتمي للأمام مقابل قطع نقاط التشتت الجانبية اللوغاريتمية.
بعد ضبط الفولتية حسب الضرورة، سجل الخلايا ذات لون واحد الملون لعناصر التحكم في التعويض. الآن تشغيل عينة التحكم الإيجابية للحصول على ما يكفي من الخلايا لضبط التعويض والبوابات. ثم الحصول على وتسجيل 100،000 الأحداث لكل عينة الدم كله، وتحليل تدفق البيانات cytometry باستخدام المؤامرات المناسبة والبوابات.
إذا تم إضافة الدم إلى المتوسط ببطء، فإن المتوسط التدرج iohexol وعينة الدم تشكل طبقتين منفصلتين في الأنبوب. بعد الطرد المركزي، أعلى، طبقة القش الملونة يحتوي على البلازما ولكن لا خلايا الدم سليمة. والثانية، بيضاء، طبقة غنية بالصفائح الدموية يحتوي على غالبية الصفائح الدموية.
أما الطبقة الثالثة الشفافة فهي طبقة الصفيحات الفقيرة وهي فوق خلايا الدم الحمراء مباشرة وبيضاء خلية الدم. الدم كله معارض مجموعات متميزة من خلايا الدم الحمراء، وخلايا الدم البيضاء، والصفائح الدموية على مبعثر لوغاريتمي إلى الأمام مقابل الجانب مؤامرة نقطة مبعثر. ومع ذلك، تظهر الصفائح الدموية النقية مجموعة سكانية متميزة مع أعداد لا تذكر من خلايا الدم الحمراء أو البيضاء.
تحتوي عينات الدم الكامل على خلايا الدم الحمراء الإيجابية Ter119 و CD45-positive خلايا الدم البيضاء التي تكاد تكون غائبة في عينات الصفائح الدموية النقية. الصفائح المنقية غير المعالجة تعبر عن أي علامات تنشيط تؤكد حالة الراحة الخاصة بها تقريبًا ، في حين أن الصفائح الدموية المعالجة بالخثارة النقية عادة ما توضح تعبير P-selectin بنسبة 71٪. التقييم المجهري لعينات الصفائح الدموية النقية غير المعالجة يكشف عن عدم وجود تراكم الصفائح الدموية.
بعد التنشيط مع ثرومبين، ومع ذلك، فإن الصفائح الدموية تظهر تجميعا قويا، مما يؤكد المزيد من قدرتها على البقاء بعد تنقية كما هو مبين. طبقة عينة الدم بعناية على المتوسط iohexol، وعند جمع الصفائح الدموية، تأكد من الطامح بعناية لعدم جمع خلايا الدم الحمراء وطبقات خلايا الدم البيضاء لتنقية الصفائح الدموية الناجحة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتنقية الصفائح الدموية من الأنواع الأخرى كذلك.
الصفائح الدموية النقية يمكن استخدامها للتعبير الجيني، والتنشيط، والتجميع، وإطلاق الحبيبات، ودراسات التصاق.
