يساعد هذا البروتوكول الناس على تحليل مورفولوجيا الخلايا البطانية، والتعبير عن الجزيئات في المناطق، تحت إجهاد القص السائل مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تقييمًا مباشرًا للخلايا البطانية الوعائية تحت إجهاد القص السائلي المختلف. عند تنفيذ هذا الإجراء، والخطوات الرئيسية هي استخدام الـ paraformaldehyde المعد حديثاً وإجراء عملية ضخ جيدة.
ابدأ هذا الإجراء ب التخدير من ماوس C57BL/6 12 أسبوعًا، كما هو موضح في بروتوكول النص. تأكيد التخدير السليم عن طريق معسر بلطف الذيل. الشريط الكفوف الماوس إلى كومة من المناشف الورقية، مع شريط لاصق.
احمل جلد الفأر بالملقط، وقطع الجلد بمقص من البطن إلى أعلى الصدر. افتح تجويف البطن، أسفل القفص الصدري، مع مقص حاد. رفع القص مع ملقط، وقطع الحجاب الحاجز.
ثم قطع الصدري لفضح تجويف الصدر. قطع فينا كافا فقط فوق الكبد مع مقص. يُضخ الضغط الشجرة الشريانية لمدة خمس دقائق، مع وجود ملح ملح طبيعي مُبرد مسبقًا يحتوي على 40 وحدة لكل ملليلتر من الهيبارين، من خلال البطين الأيسر، حتى تصبح الرئتين والكبد شاحبتين.
ثم تضخ مع ما قبل مبردة 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة أربع دقائق. إزالة جميع العضلات, أعضاء, والدهون, حتى يتعرض الشريان الأورطي. ضع الفأر تحت مجهر تشريح.
استخدام ملقط حساسة وزوج من مقص دقيق لفضح الشريان الأورطي بوضوح تحت المجهر تشريح, وإزالة النسيج الضام على طول الشريان الأورطي, نظيفة قدر الإمكان. تشريح الشريان الأورطي الصدري من القلب إلى جذع الاضطرابات الهضمية مع زوج من مقص دقيق. ضع الشريان الأورطي في طبق ثقافة الخلايا ستة سنتيمترات، مع برنامج تلفزيوني.
قطع فتح الشريان الأورطي طوليا، أولا على طول المنحنى أقل، ومن ثم استخدام microscissors لقطع فتح الفروع الثلاثة من القوس الأبهر، بما في ذلك السمة، غادر السباتي المشترك، والشريان تحت التلقفي الأيسر على طول منحنى أكبر حتى يتم الوفاء الجزء المستقيم. Permeabilize الشريان الأورطي مع 1٪ البولي أوكسي إيثيلين ثمانيل الفينيل الأثير، في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. ثم كتلة الشريان الأورطي مع مصل الماعز العادي 10٪ في محلول ملحي tris المخزنة يحتوي على 2.5٪ polysorbate 20 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، في لوحة ثقافة 12 خلية جيدا.
المقبل احتضان الشريان الأورطي في العازلة حظر تحتوي على خمسة غرامات لكل ميليلتر أرنب مضاد VCAM1، وخمسة غرامات لكل ملليلتر الفئران المضادة VE-Cadherin، بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بعد شطف العينة ثلاث مرات مع محلول الغسيل ، وتطبيق الأجسام المضادة الثانوية المضاءة لساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، مع الحفاظ على مكان مظلم. شطف ثلاث مرات أخرى في محلول الغسيل.
ضع الـ Aa Countersing في الشريان الأورطي مع DAPI لمدة 10 دقائق، مع الاحتفاظ في مكان مظلم. ثم شطف الشريان الأورطي الملون ثلاث مرات في محلول الغسيل. ضع الشريان الأبهر على زلة غطاء مع سطح التجويف إلى الأسفل ، واحركه ببطء إلى حل تصاعد antifade الذي تم إسقاطه سابقًا على زلة الغطاء.
تمتد بلطف الشريان الأورطي للحفاظ على شقة العينة. عكس زلة الغطاء ووضعها على الشريحة الزجاجية. الحرص على تجنب أي فقاعات الهواء بين العينة والزجاج.
فحص الشريان الأورطي مع مجهر ليزر المسح confocal. تحليل كثافة الألوان من قنوات مختلفة من المنطقة المطلوبة في صور الوجه en، مع برنامج Image-Pro Plus. تظهر صور تلوين الفلورات المناعية في الوجه للخلايا البطانية الوعائية من الشريان الأبهر الماوس.
En المناعة في مواجهة بروتين التصاق الخلايا الوعائية واحد ، والتعبير مع VE-Cadherin كعلامة بطانة ، تظهر تحت أنماط تدفق مختلفة من مناطق مختلفة من الشريان الأبهر الماوس. كما تم عرض DAPI لإظهار نواة الخلية من أجل رؤية أفضل. عند النظر من خلال مداخن Z تحت المجهر، يمكن تمييز خلايا العضلات البطانية والسلسة بسهولة من قبل مورفولوجيا الخلايا الخلوية.
نواة الخلية البطانية بيضاوية الشكل، وأكبر من محور الدوران، نواة الخلية العضلية الملساء. كان التعبير عن VCAM-1 أكثر وفرة في المناطق التي تشهد تدفقًا مضطربًا ، عند انحناء أقل من قوس الشريان الأورطي ، مقارنة بالمناطق التي تشهد تدفقًا ثابتًا ، عند انحناء أكبر في قوس الأبهر ، وفي الشريان الأبهر الصدري. هنا يشار إلى المناطق من انحناء أقل من الشريان الأورطي الماوس كمساحات د التدفق، وأكبر انحناء وصدر.
مع التعديل الصحيح ، يمكن تطبيق هذه التقنية أيضًا على تحليل نفاذية الأوعية الدموية ، وموقف الجزيئات في الخلية البطانية.
