يتم استخدام الفيليات خارج الخلية بشكل متزايد كعلامة حيوية تشخيصية وأداة علاجية محتملة في العديد من المجالات. تدفق Cytometric هو الأسلوب التحليلية الأكثر استقامة لتميز من قبل علامات دعوى تواجه هذا البروتوكول يمكن استخدامها في تحليل الجسيمات assized، هو سريع، وينطبق على مقاييس الزلازل التقليدية دون الحاجة إلى الإعداد الخاص أو أداة مخصصة. على الرغم من أن يتم استخدام هذا البروتوكول لتصنيف الفينات خارج الخلية من الحالة المتوسطة المذكورة ، يمكن توسيعها نحو تصنيف الدم AVs وصلت ، لتحل محل خزعات الأنسجة الغازية في المرضى.
بالنسبة للباحثين الجدد على البروتوكول ، من الأهمية بمكان تنفيذ الخطوات الموصوفة في قسم طريقة الإعداد ، والمتابعة عن كثب لاستراتيجيات الحصول على البينة Begin عن طريق طلاء 55 سنتيمترًا مربعة بأطباق بيتري - أطباق مع الجيلاتين الجلدي البورسين بنسبة 02٪، في PBS. بعد 15 دقيقة، اغسل الطبق والصحن 4.4 مرات 10 إلى الخلايا السلف القلبية الخامسة على كل طبق في 7 ملليلتر من متوسطة Dulbecco المعدلة في إيسكو، أو IMDM، وتستكمل مع 20٪ مصل البقر الجنين، و 1٪ من البنسلين وstreptomycin لاحتضانها في 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ التقاء، وغسل الثقافات مرتين مع برنامج تلفزيوني دولبيككو دون الكالسيوم والمغنيسيوم وتغذية الخلايا مع 10 milileters من مصل خال من إنتاج الاحتياج المتوسطة.
بعد 7 أيام، قم بتجميع الوسيطة المُكيفة من كل صفيحة، في أنبوب واحد من أجهزة الطرد المركزي من البولي بروبلين وطاردة مركزية لإزالة أي حطام خلية. نقل supernatent في أنبوب تصفية الطرد المركزي 100 كيلودالتون، وتركيز مسح، مكيفة، المتوسطة مع طرد مركزي إضافية. نقل التركيز إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير للطرد المركزي النهائي سطح المقعد وإضافة supernatent في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير الجدار سميكة البولي.
ملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني، إلى حجم النهائي من 3.2 milileters، وتحميل العينة في الدوار التيتانيوم ملائكية ثابتة. ثم تحميل الدوار في الطاولة فائقة الrifuge للطرد فائقة المركز ، وإعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد. لتتبع الجسيمات النانوية وتحليلها، تمييع 1 ميكرولتر من العينة فائقة التركيز، في 999 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وتحميل العينة في حقنة 1 milileter دون فقاعات.
قم بتحميل الحقنة في مدخل مدخل غرفة الفحص، ثم قم بتشغيل الليزر. استخدم زر الالتقاط لفتح الكاميرا وضبط التركيز. ثم سجل ما لا يقل عن ثلاثة إطارات مختلفة من 60 ثانية لكل من هذه ، واستخدام خيار عملية الدفعة في البرنامج ، لتحليل المقتنيات الثلاثة المختلفة.
لإعداد العينة للحصول عليها، أولاً إضافة الأجسام المضادة أحادية النسيلة التجريبية المناسبة الخرز التقاط مترافق في نسبة 1:1:1، في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير، ودوامة تجمع حبة التقاط الناتجة. بعد ذلك، إضافة حجم مناسب من العينة إلى 1 ميكرولتر من حمام سباحة التقاط لتوليد 1 مرات 10 إلى 8 جسيمات بالإضافة إلى 1.2 مرات 10 إلى الخرز 5 لكل تركيز الاختبار. إضافة 1 ميكرولتر من الخرز إلى أنبوب يسمى الخرز والتحكم السلبي، وضبط حجم في كل أنبوب إلى 100 ميكرولترات مع برنامج تلفزيوني جديد.
ثم ضع الأنابيب في خلاط حراري ، مع اهتزاز ، بمعدل 400 دوران في الدقيقة ، و 4 إلى 10 مئوية ، بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، نقل العينات إلى أسفل 96 لوحة جيدة جولة، وإضافة الأجسام المضادة لمعالجة الفلوريس المناسبة لكل بئر. بعد 1 ساعة حضانة في 4 إلى 10 درجة مئوية، إضافة 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر، وفتح البرمجيات اقتناء.
حدد مقياس السيت ونظام بدء تشغيل البرنامج، لبدء تشغيل الصك وفتح تجربة جديدة. إنشاء قالب تجريبي، وحدد لوحة وإضافة لوحة. حدد موقف العينات على لوحة، وانقر فوق مجموعة عينة جيدا.
أدخل اسم العينة في قواعد التسمية، وافتح علامة التبويب القناة، وحدد قنوات إشارة الفلوركين المناسبة. الآن تحميل لوحة في الصك. وانقر على مؤامرة نقطة، لإنشاء منطقة جديدة إلى الأمام مبعثر مقابل الجانب منطقة نقطة مبعثر مؤامرة.
حدد تهيئة لبدء الليزر ومائعات وانقر فوق تشغيل لبدء عملية الاكتساب. ضبط مقياس لإظهار السكان في منتصف مؤامرة إلى الأمام مقابل الجانب مبعثر، ورسم بوابة الخرز حول مجموعة عينة كاملة لاستبعاد الحطام. انقر فوق إيقاف و نقطة مؤامرة لإنشاء ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل رسم نقطة نقطة مبعثر إلى الأمام، وبوابة العينة على السكان الخرز.
رسم بوابة جديدة حول أكبر عدد السكان وتسمي ذلك Singlets، وانقر فوق مؤامرة نقطة لإنشاء إشارة الفلورسنت واحد مقابل الجانب منطقة نقطة نقطة مؤامرة، لكل الفلوروفور التجريبية المستخدمة. بوابة مؤامرة نقطة جديدة على Singlets. ثم حدد عدد الأحداث التي تريد تسجيلها، ثم حدد السجل لبدء عملية الاستحواذ التجريبية.
في نهاية التحليل، قم بتحميل ملفات الاكتساب في برنامج التحليل المناسب، ثم افتح بروتوكول جديد. إنشاء نقاط لكل ملف كما هو موضح فقط، وتعيين كل من محور مبعثر إلى مقياس خطي، وجميع من محور فلورسنت لمقياس السجل. ثم إظهار متوسط هندسي florescence في قنوات الإشارات ذات الصلة، لحساب التغيير الكامل في شدة الفلوريس متوسط، في مختلف الاستعدادات خارج الخلية.
بعد اختبار ظروف مختلفة لتعيين أصغر كمية إجمالية من العوائل خارج الخلية للوصول إلى المرحلة الأسية المبكرة من منحنى شدة الفلورس المتوسط ، تم تحديد الحد الأدنى لعدد الجسيمات ليكون 1 مرات 10 إلى 8 جزيئات لكل تلطيخ. تم تحديد التركيز الأمثل للأجسام المضادة ل1 مرات 10 إلى 8 جزيئات لتحقيق أعلى إشارة دون ربط الأجسام المضادة غير محددة ، ليكون 10 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل من الأجسام المضادة CD9_FITC ومضادة CD63_PE وخمس ميكروغرام لكل ملليلتر للجسم المضاد CD81_PE. لتأكيد ملاءمة الأسلوب، لتحليل كأس على شكل الحويصلات خارج الخلية، وليس الحطام الغشاء، والحويصلات خارج الخلية كانت سونيكاتيد، مما أدى إلى انخفاض في شدة الفلورس متوسط، بعد أقل من 30 ثانية من سونيكيشن، مع عدم اكتشاف فلوركينس على الإطلاق بعد دقيقة واحدة من اضطراب الميكانيكية.
X تنقية الخاصة من خلايا السلف القلبية كما هو موضح، وأسفرت عن خلايا خارج الخلية، معربا عن مستويات منخفضة من CD9 ومستويات عالية من CD63 و CD81 من كل من السكان الخلية. وعلاوة على ذلك، في حين أن علامات سطح X الخاصة يمكن التعرف عليها بوضوح دون طرد فائق التركيز، فإن خطوة الإثراء هذه تعزز إلى حد كبير شدة الفلورس الوسطي لهذه العلامات. عند العمل مع الخلايا خارج الخلية، هناك أكثر من الإهمال الجسيمات نانو الكريات يمكن أن يغيب بسهولة.
لذلك، من الضروري اتباع كافة الخطوات كما هو موضح في البروتوكول. استخدام الفيليات خارج الخلية كعلامة حيوية هو الآن واحد من البحوث الميدانية الأكثر الناشئة. وقريباً، قد تُترجم إلى التشخيص السريري المستخدم كأداة فحص بديلة.
