يمكّن هذا البروتوكول الباحثين من مراقبة البقاء على قيد الحياة على أساس خلية واحدة وتحديد المتغيرات التي تتنبأ بشكل كبير بموت الخلية أو بقائها. تقيّم مقايسات السمية الخلوية التقليدية مجموعات الخلايا وتفتقر إلى القدرة على التمييز بين الخلايا الفردية. يسمح المجهر الطولي بتخصيص وقت الوفاة لكل خلية في السكان.
هذه التقنية مناسبة تماما لتقييم العلاجات الجديدة للأمراض العصبية وغيرها من الحالات. وقد ثبت أن هذه الطريقة لا تقدر بثمن لاستكشاف آليات المرض في الظروف العصبية التنكسية، ويمكن تطبيقها مع نفس الفعالية تجاه الاضطرابات الأخرى التي موت الخلايا هو من الفائدة. وقد يكافح الباحثون من أجل تحقيق كفاءات كافية في عملية نقل النفايات دون سمية لا داعي لها.
وينبغي أن الممارسة مع pipet متعدد القنوات والإلمام مع بروتوكول يقلل من هذه الصعوبة مع مرور الوقت. المجهر هو منهجية بصرية بطبيعتها. لذلك، قد يكون من السهل فهم هذه التقنية من خلال مشاهدة بالإضافة إلى القراءة.
للبدء، والجمع بين كمية مناسبة من وسائل الإعلام المصل انخفاض ومبيد transfection في أنبوب واحد، وانخفاض وسائل الإعلام في المصل والحمض النووي في أنبوب منفصل. احتضانهم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم، والجمع بين محتويات كل من أنابيب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
استخدام الأنابيب متعددة القنوات وأحواض بلاستيكية معقمة لغسل الخلايا العصبية القشرية مرتين مع 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام القاعدية العصبية في البئر. وتخزين وسائل الإعلام مكيفة وغيرها من وسائل الإعلام المتبقية في 37 درجة مئوية. استبدل NBM بـ 100 ميكرولترات من محلول NBKY المعد مسبقًا في البئر.
بعد 20 دقيقة، pipet 50 ميكرولترات من كاشف transfection وخليط الحمض النووي قطرة في كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. شطف الخلايا مرتين مع حل NBKY.
ثم إضافة 100 ميكروليتر من وسائل الإعلام مكيفة و 100 ميكرولترات من حل ان بي سي إلى الآبار. لبدء تصوير الخلايا، ضع لوحة 96 بئرًا على مجهر فلوري. استخدم علامة ائتمانية فريدة لكل لوحة كمرجع للمحاذاة المستقبلية، واحفظ صورة كمرجع مستقبلي.
ثم انتقل إلى المناطق ذات الاهتمام وسجل إحداثيات س و ص الخاصة بهم بالنسبة إلى العلامة. استخدم علامة ائتمانية فريدة لكل لوحة كمرجع للمحاذاة المستقبلية، واحفظ صورة كمرجع مستقبلي. وأخيراً، ركز على الخلايا المصابة عبر الثانية التي تعبر عن ملصق فلوري.
التقاط صور متعددة على فترات متباعدة بانتظام في القنوات الفلورية المناسبة. لتبدأ مع معالجة الصور، انقر نقرا مزدوجا على رمز فيجي. ثم انقر ثم اسحب ماكرو معالجة تسطير أسفل السطر إلى شريط فيجي لفتح الماكرو داخل فيجي.
ضبط الأسطر من اثنين إلى سبعة من الصورة تسطير أسفل السطر معالجة الماكرو وفقا لبروتوكول النص. ثم، انقر على خياطة، ومن ثم خياطة الشبكة / جمع. اضبط الإعدادات داخل القوائم المنسدلة، واكتبها، ثم اطلبها، حتى يتم إنتاج صورة مخيط بدقة.
ضبط نوع الشبكة ومتغيرات ترتيب الخيوط في السطور ثمانية وتسعة وفقاً لهذه التحديدات. ثم، ضبط خط 10 لتحديد عدد الصور في البئر وتعيين خيار طرح الخلفية في سطر 14 إلى true، إذا لزم الأمر. قم بضبط الخط 15 لتعيين نصف قطر الكرة المتداولة وفقاً لبروتوكول النص، ثم انقر فوق تشغيل.
وأخيرا، فتح كومة صورة الإخراج والتعرف يدويا الخلايا العصبية الميتة وفقا لبروتوكول النص. تسجيل البيانات في ملف جدول بيانات. لإجراء التحليل الإحصائي، انقر نقراً مزدوجاً على أيقونة البقاء على قيد الحياة.
R النصي. تمييز السطر الثاني وانقر فوق زر التشغيل لتحميل مكتبة البقاء على قيد الحياة. ثم قم بتغيير المسار في السطر الخامس لاستدعاء جدول بيانات الإدخال ثم انقر فوق زر التشغيل.
تمييز الخطين الثامن و التاسع، وانقر على زر التشغيل لإجراء تحليل المخاطر النسبية في كوكس. تمييز الخطوط 12 إلى 16 و 19 إلى 24. انقر فوق زر التشغيل لرسم الخطر التراكمي للموت وبيانات البقاء على قيد الحياة كمنحنى كابلان ماير.
في هذه الدراسة، تم إصابة الخلايا العصبية القشرية الفئران في أربعة أيام بعد الطلاء مع ترميز البلازميد البروتين الفلورسنت M التفاح. 24 ساعة بعد transfection، تم تصوير الخلايا العصبية عن طريق المجهر الفلوريسنس كل 24 ساعة لمدة 10 أيام متتالية. بعد الحصول على الصور، تمت معالجة الصور وفحصها بالتتابع للاحتفال بموت الخلية.
تم تحديد وقت الوفاة لكل خلية من خلال التغيرات في الفلور، مورفولوجيا، وتفتيت جسم الخلية. كوكس تحليل المخاطر النسبية التي أجريت على بيانات البقاء على قيد الحياة من الخلايا العصبية متحولة أدى إلى نسبة خطر 2.2. وأشارت هذه النتيجة إلى معدل أسرع من الوفيات في الخلايا العصبية متحولة بالمقارنة مع السكان من النوع البرية.
أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء هو pipet بعناية. إن تقليل التعرض للهواء وتجنب الفقاعات أمر بالغ الأهمية لنجاح عملية نقل الهواء. بعد التنمّر، يمكن استخدام المجهر الفلوري الطولي لتتبع العوامل المختلفة التي قد تساهم في موت الخلايا، بما في ذلك توطين البروتين، ودوران، ومستوى التعبير، بالإضافة إلى بقاء الخلية.
وفي مجال الانحطاط العصبي، ألقت الطبيعة الديناميكية للمجهر الطولي الضوء على ما إذا كان تجميع البروتينات المرتبطة بالأمراض يمثل حدثاً ساماً أو وقائياً. ولا تشكل أي من هذه الكواشف أو الأدوات خطرا.
