يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة، مثل فهم التغيرات في التعبير الجيني عبر آلاف الخلايا الفردية بعد الإصابة أو المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتشريح نسخ الخلايا الفردية داخل نسيج معقد ، وتقدير الديناميكيات الوظيفية بشكل أفضل داخل مجموعة سكانية معينة. وميزة بروتوكولنا هو أنه يوفر أساليب شاملة، من عزل الخلايا الفردية في الأنسجة الأولية، إلى تحليل وتصور مجموعة البيانات هذه.
على الرغم من أن هذه الطريقة تبدأ من التعليقات أحادية الخلية من الجلد والعصب، يمكن تطبيق أساليب التسلسل التي وصفناها لدراسة أي أنسجة الثدييات. إثبات هذا الإجراء سيكون (إلودي لابيت) و(ويسو شين) متدربان من مختبري للبدء ، تشريح العصب الوركي من الماوس القتل الرحيم عن طريق قطع الجلد أولا بعيدا عن المنطقة الخلفية من الجزء الخلفي من الماوس.
استخدم شفرة مشرط معقمة لعمل شق على طول الفخذ. ثم استخدام ملقط غرامة ومقص لفضح وإزالة العصب الوركي. لتشريح الجلد الظهري، استخدم ملقط ومقصات دقيقة لعمل شقوق من كتف إلى كتف، عبر الردف، وإلى أسفل الظهر.
غسل الأنسجة مرتين مع الجليد الباردة HBSS. تحت المجهر تشريح، وإزالة النسيج الضام غير المرغوب فيها، ورواسب الدهون، أو الحطام. للجلد فقط، وقطع الجلد إلى شرائح رقيقة، وذلك باستخدام شفرة مشرط معقمة.
للحصول على أدمة الجلد، تعويم شرائح الجلد في dispase، في HBSS في طبق 10 سم، لمدة 30 إلى 40 دقيقة في 37 درجة مئوية. استخدم ملقط ناعم لتقشير البشرة وفصلها عن الأدمة، ثم تخلص من البشرة. ثم، للجلد والأعصاب، واستخدام زوج من شفرات مشرط معقم ل mince كل عينة في قطعة ملليمتر واحد إلى اثنين.
ضع قطع الأنسجة في ذوبان حديث ، غرامين لكل ملليلتر كولكولاجيناز -أربعة إنزيم بارد في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. احتضان كل عينة في الإنزيم في حمام 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف كل 10 دقائق. في 30 دقيقة، واستخدام أنبوب P1000 ل triturate الأنسجة 20 إلى 30 مرة، والعودة إلى حمام الماء.
كرر التثاثر كل 30 دقيقة حتى يبدو المحلول غائمًا ، ويتم فصل قطع الأنسجة إلى حد كبير. للبشرة فقط، في الساعة الأخيرة من الحضانة، إضافة ملليغرام واحد لكل ملليلتر DNAse إلى عينة الجلد. منذ بعض أنواع الخلايا هي أكثر حساسية من غيرها للإجهاد الميكانيكية، وتقنيات التحلل المفرط يمكن التحيز السكان الخاص بك.
إن الانفصام العام أمر بالغ الأهمية لتحقيق غلة الخلايا العالية، والتمثيل الدقيق لتكوين الأنسجة. بعد ذلك، استخدم فلتر 40 ميكرومتر على رأس أنبوب مخروطي 50 ملليلتر لتصفية كل عينة الأنسجة مرتين. شطف المرشح مع واحد في المئة BSA / HBSS.
بعد الطرد المركزي للعينات كما هو موضح في المخطوطة، إعادة تعليق بيليه الخلية في HBSS، التي تحتوي على واحد في المئة BSA، وذلك باستخدام طرف واسعة تتحمل، ووضع على الجليد. إضافة صبغة القدرة على البقاء سوف تساعدك على تحسين إعداد الخاص بك. يجب أن تهدف إلى خلايا قابلة للحياة بنسبة 80 في المائة على الأقل.
مرة واحدة الأمثل، يمكن حذف هذا وغيرها من خطوات مراقبة الجودة من أجل تعجيل عملية الانفصال، والتي سوف تحافظ على جودة الحمض النووي الريبي بشكل أفضل والحد من فقدان الخلايا. لعزل الخلايا القابلة للحياة وصحية باستخدام FACS، أولا إعداد 15 ملليلتر أنابيب ضيقة القاع مع ثمانية ملليلتر من الجليد الباردة واحد في المئة BSA / HBSS لمجموعات العينات. لضمان أن الواجهة بين سطح السائل وداخل الأنبوب رطبة ، ولمنع التوتر الساكن والسطحي ، عكس الأنابيب قبل المجموعات.
مباشرة بعد فرز الخلايا FACS، مرة واحدة يتم جمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر، استخدام ملليلتر واحد من واحد في المئة BSA / HBSS لغسل ودفع جميع الخلايا إلى أسفل من السطح الجانبي للأنبوب. ثم الطرد المركزي كل عينة في 260 غرام لمدة ثماني دقائق. بعد التخلص من المابير، إعادة تعليق بيليه الخلية في واحد في المئة BSA / HBSS، وإضافة 33.8 ميكرولترات إلى أنبوب، والحفاظ على هذا الأنبوب على الجليد.
تم تصميم هذه الخطوة ليتم القيام به باستخدام الكواشف التي تم الحصول عليها من مجموعة موحدة. يجب تنفيذ كافة الخطوات التي تم عرضها باتباع إرشادات الشركة المصنعة. للتحضير لجيل GEM ، ضع رقاقة في حامل الشريحة ، وإعداد مزيج رئيسي الخلية على الجليد ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
إضافة 56.2 ميكرولترات من المزيج الرئيسي إلى أنبوب يحتوي على 33.8 ميكرولترات من التعليق الذاتي. لإعداد رقاقة، أولا في 50 في المئة الجلسرين إلى الآبار التي لن تستخدم. ثم إضافة 90 microliters من مزيج سيد الخلية إلى حد ما واحد، 40 microliters من حبات هلام إلى اثنين جيدا، و 270 microliters من النفط تقسيم إلى ثلاثة جيدا.
غطي الرقاقة بـ حشية لتحميل الرقاقة وتشغيلها في وحدة تحكم ذات خلية واحدة، قم أولاً بإخراج الدرج. ضع الرقاقة في الدرج.
اسحب الدرج، واضغط على تشغيل. بعد المدى الكامل، وجمع 100 ميكرولترات من العينة، ووضعها في أنبوب PCR. ضع أنابيب PCR في جهاز PCR مسبقًا ، وركض وفقًا للطقم.
بعد المدى، سوف تشمل GEMs كامل الطول، cDNA الباركود، من الحمض النووي الريبي متعدد الدنا. ضع الأنابيب عند درجة حرارة 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تابع عملية إنشاء المكتبة وتسلسلها ومحاذاتها وتحليلها.
وبمجرد أن يتم ترتيب العينات وتواؤمها كما هو موضح في المخطوطة، قم بإيداع البيانات في مستودع عام، مثل توقعات البيئة العالمية لـ NCBI. للقيام بذلك، قم بالتسجيل لحساب مقدم. أولاً، أكمل تقديم تقرير توقعات البيئة العالمية عن طريق تنزيل ورقة البيانات الوصفية.
تأكد من تضمين ورقة بيانات تعريف واحدة فقط لكل مشروع إرسال. ضع جدول البيانات في الدليل. ثانياً، إضافة ملف البيانات الخام التي تم إنشاؤها من البرنامج النصي عدد الحارس الخلية لكافة المكتبات في الدليل.
المجلد الثالث هو ملفات البيانات التي تمت معالجتها. وضع ملفات البيانات المعالجة التي تم إنشاؤها من برنامج نصي عدد خلية الحارس لكافة المكتبات في الدليل. استخدام بيانات اعتماد خادم FTP الخاص بـ GEO الخاص بـ GEO لنقل الدليل الذي يحتوي على كافة المكونات الثلاثة.
بعد تشغيل الخلية الحارس، يمكن معالجة المصفوفات الباركود الجينات جاهزة التحليل باستخدام المعلوماتية الحيوية المتقدمة. أولاً، تم إجراء عمليات فحص كمية ما قبل المعالجة باستخدام حزمة Seurat R، التي ولدت قطع الكمان والمبعثرة لتصور عدد الجينات، وعدد المعرفات الجزيئية الفريدة، والنسبة المئوية للجينات الميتوكوندريا لتحديد مزدوجة الخلايا و القيم المتطرفة. لاختيار المكونات الرئيسية، أو أجهزة الكمبيوتر، تم استخدام مخططات الكوع، التي تم استبعاد أجهزة الكمبيوتر خارج هضبة الانحراف المعياري لمحور الكمبيوتر.
كما تم التلاعب بحل التكتلات. أدى دقة منخفضة إلى عدد أقل من مجموعات الخلايا، مع كل كتلة تمثل على الأرجح نوع خلية معرّفة. أدى الدقة العالية إلى احتمال أعلى للخلية، تمثل الأنواع الفرعية، أو الحالات الانتقالية، من مجموعة الخلايا.
واستُخدمت إعدادات الكتلة ذات الدقة المنخفضة لإجراء مزيد من التحليل للخرائط الحرارية للتعبير لتحديد الجينات الأكثر تعبيراً عنها في مجموعة معينة. تم تصور الجينات المرشحة الفردية على المؤامرات tSNE ، وذلك باستخدام وظيفة مؤامرة ميزة سورات ، التي سمحت فك ، ما إذا كانت هناك مجموعات التي تمثل ، على سبيل المثال ، الضامة. وأعرب كل من الكتلة الثانية وأربعة CD68، علامة عموم الضامة.
كما توفر حزم أخرى أدوات لمراقبة الجودة، على سبيل المثال، Monocle، وهي حزمة R تستخدم لبناء مسارات الخلايا، وتزيل الخلايا ذات النوعية الرديئة، وتضمن أن توزيع مرنا عبر جميع الخلايا طبيعي، وسقط بين الحدود العليا والسفلى. ثم تم تصنيف الخلايا الفردية وإحصاءها، باستخدام جينات علامات النسب المعروفة، وتم تعيين الخلايا التي تعبر عن علامات الاهتمام إلى نوع الخلية رقم واحد. تم تحديد أن نوع الخلية رقم واحد كانت الخلايا الليفية.
تم تقييم هذه الفئة من السكان لبناء المسار التنموي للخلايا الليفية. بعد هذا الإجراء، وينبغي تنفيذ أساليب أخرى مثل PCR الكمية، والتهجين في الموقع، والكيمياء immunist للتحقق من صحة نتائج التعبير الجيني الخاص بك. وقد مهد تسلسل مرنا أحادي الخلية الآن الطريق للباحثين في العديد من المجالات المختلفة لاستكشاف عدم التجانس من خلية إلى خلية ، وتحديد الديناميات الوظيفية داخل الأنسجة المختلفة أثناء التوازن ، وكيف يمكن أن تتغير هذه بعد الإصابة أو في تطور المرض.
