يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بإعداد المسار الأيضي في خلايا سرطان الدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس عملية التمثيل الغذائي لخلايا سرطان الدم الأولية في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. تبدأ عن طريق تخفيف عينة نخاع العظام التي تم الحصول عليها من مريض سرطان الدم في برنامج تلفزيوني بنسبة واحد إلى واحد.
بعناية، طبقة ستة ملليلتر من العينة نخاع العظام المخفف أكثر من ستة ملليلتر من متوسط التدرج الكثافة المعدة حديثا في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي الكثافة. استخدام pipet باستور لنقل بعناية طبقة واجهة من الخلايا أحادية النواة إلى أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لغسل الطرد المركزي. ثم، resuspend بيليه خلية أحادية النواة في مليلترين من برنامج تلفزيوني عقيمة للعد.
تخفيف الخلايا إلى ثلاث مرات 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر التركيز. وإضافة ملليلتر واحد من الخلايا إلى كل من اثنين من قارورة T75 التي تحتوي على 20 ملليلتر من متوسطة RPMI لاحتضان 16 إلى 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. وفي الوقت نفسه لإعداد لوحات لتحليل تدفق خارج الخلية، إضافة 12.5 ميكرولترات من حل لاصق الخلية في كل بئر اثنين، ثمانية جيدا لوحات محلل تدفق خارج الخلية.
بعد 20 دقيقة، الاستنشاق لاصق الخلية وغسل كل بئر مرتين مع 200 ميكرولترات من الماء المعقم في غسل. بعد الغسيل الثاني، اترك الأطباق في غطاء محرك السيارة حتى تجف الآبار. ووضع خرطوشة الاستشعار رأسا على عقب على مقاعد البدلاء في المختبر.
فصل لوحة الأداة المساعدة وخراطيش الاستشعار من محلل تدفق. وملء كل بئر من لوحة فائدة مع 200 ميكرولتر من الكاليبريانت وكل خندق حول خارج الآبار مع 400 ميكرولترات من الكاليبانت. ارجع خرطوشة المستشعر إلى لوحة الأدوات التي تحتوي الآن على الكاليبريانت ووضع تجميع الخراطيش في حاضنة 37 درجة مئوية مرطبة بدون ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها.
ثم بدوره على محلل تدفق خارج الخلية والسماح لها الحارة إلى 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، نقل الخلايا من قارورة إلى أنابيب مخروطية 50 ملليلتر للطرد المركزي. وإعادة تعليق الكريات في ملليلتر واحد من المتوسط التجريبي المناسب للعد.
resuspend الخلايا في أربع مرات 10 إلى الخلايا الست في 400 ميكرولترات من التركيز المتوسط التجريبي. وإضافة 50 ميكرولترات من الخلايا في الآبار B من خلال G من لوحة محلل التدفق. و 180 ميكرولترات من المتوسط التجريبي إلى الآبار A و H كآبار التحكم في الخلفية.
بعد الطرد المركزي ببطء وبعناية إضافة 130 ميكرولترات من المتوسط التجريبي إلى الآبار B من خلال G.، ويؤكد بصريا ثبات ثبات الخلايا في الجزء السفلي من كل بئر تحت المجهر. ثم العودة لوحة تحليل تدفق إلى حاضنة 37 درجة مئوية المرطب دون CO2 لمدة 30 دقيقة. 20 دقيقة قبل نهاية الحضانة، تحميل المركبات في منافذ الحقن المناسبة من خرطوشة وفقا للبروتوكول التجريبي كما هو مبين في الجدول.
ثم قم بإعداد برنامج تحليل تدفق خارج الخلية المناسب. بدء البرنامج واستبدال لوحة calibrant مع لوحة المقايسة عند المطالبة. في اختبار الإجهاد تحلل، يتم استخدام المتوسطة القاعدية فقط بحيث يتم حرمان الخلايا من المواد الغذائية.
المعلمة الأولى التي تم الحصول عليها هي التحمض القاعدي الذي يجب أن يعكس كمية الجلوكوز المخزنة في الخلايا. بعد الحقن الأول، يتم زيادة معدل التحمض خارج الخلية حيث أن الخلايا تستخدم الجلوكوز ويمكن أن تخمر الجلوكوز لالكتات. و oligomycin A في الحقن الثاني يمنع ATP synthase ، وبالتالي يوجه الخلايا لإنتاج ATP أساسا عن طريق تحلل مما تسبب في مزيد من الارتفاع من معدل التحمض خارج الخلية.
في حين أن حقن 2-Deoxy-D-الجلوكوز يمنع تماما تحلل الغلاء وينخفض معدل التحمض خارج الخلية. في اختبار الإجهاد ميتو الخلية، يتم استخدام متوسطة تستكمل مع الجلوتامين والجلوكوز بحيث لا تحرم الخلايا من جميع المواد الغذائية. معلمة التنفس القاعدي تعكس حالتها الأيضية القاعدية.
بعد الحقن الأول مع oligomycin A، وتمنع الخلايا التنفس الميتوكوندريا والتحول إلى تحلل الغليس الذي يمثل انخفاضا في معدل استهلاك الأكسجين. الحقن الثاني والثالث من FCCP ومع ذلك، فك إنتاج ATP من التنفس بحيث الخلايا تستهلك الآن الأكسجين بمعدل أقصى. ومعدل استهلاك الأكسجين يرتفع إلى أعلى قيمة له.
الحقن الأخير من الروتينون والمضاد A الخليط يمنع تماما التنفس الميتوكوندريا خفض معدل استهلاك الأكسجين إلى الصفر تقريبا. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم تقييم النسبة المئوية للانفجارات في العينة لضمان قياس معلمات التمثيل الغذائي لأبيضاض الدم فقط. عند تنفيذ هذا الأسلوب، يجب تطبيق التحسين حذراً على ظروف زراعة و التطبيع البيانات.
