وقد تم تطوير هذا الفحص لمعالجة الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا غشاء البلازما وتحديد مدى كفاءة الخلايا التالفة يمكن إعادة الغشاء البلازما الخاصة بهم. ويمكن استخدام هذه التقنية لقياس كفاءة إعادة الغشاء البلازما في قدرة عالية الإنتاجية وتحديد بروتينات محددة والمسارات المقابلة التي تتوسط إعادة الغشاء البلازما. تبدأ بإضافة 20 ملليلتر من 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة هيلا لكل ملليلتر من تعليق متوسط النمو في حوض ماص معقمة واستخدام ماصة المصلية 10 ملليلتر لخلط الخلايا جيدا.
المقبل, استخدام micropipette متعددة القنوات لذر البذور 100 ميكرولتردات من الخلايا في كل بئر في ثلاثية في 96-well شقة, قاع واضح, أسود البوليسترين الأنسجة ثقافة المعالجة لوحة. تذكر أن توزيع الخلايا المتجانسة هو المفتاح لتجربة ناجحة حيث أن المقارنات بين جميع الشروط التجريبية تتطلب عدد خلايا مكافئ. بعد 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، أحذر قارئ اللوحة إلى 37 درجة مئوية وتعيين التكوين البصري إلى monochromator ، وضع القراءة إلى الفلوريسانس ، ونوع القراءة إلى الحركية.
تحت إعدادات الطول الموجي، حدد 9 نانمتر الإثارة و15 نانومتر الانبعاثات bandpass. بالنسبة للمجايسات باستخدام يوديد البروديم، حدد الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات إلى 535 نانومتر و617 نانومتر، على التوالي. تحت نوع اللوحة، حدد 96-آبار لتنسيق اللوحة، وحدد تكوين لوحة مسبقة الضبط المطابق للوحة أسفل الجدار الأسود واضحة.
تحت منطقة القراءة، وتسليط الضوء على الآبار التي سيتم تحليلها في جميع أنحاء مقايسة الحركية. تحت PMT والبصريات، مسبقا ومضات لكل قراءة إلى ستة وتحديد مربع للقراءة من أسفل. ضمن التوقيت، أدخل صفر ساعة 30 دقيقة و ثواني صفر في إجمالي وقت التشغيل لمقتها 30 دقيقة الحركة وأدخل صفر ساعة خمس دقائق و ثواني صفر للفاصل الزمني.
تأكيد الإعدادات المحددة في معلومات الإعدادات ثم انقر فوق موافق. ثم انقر فوق قراءة لبدء تشغيل الحركية. لتعيين معلمات التصوير ضمن وضع الإعدادات، قم بتعيين MiniMax للتكوين البصري، والتصوير لوضع القراءة، ونقطة النهاية لنوع القراءة. تحت الأطوال الموجية، حدد الضوء المرسل ومربعات الفلورس المناسبة المقابلة للإثارة التجريبية وأطوال الموجة للانبعاثات.
تعيين نوع لوحة ومنطقة القراءة كما أظهرت للتو وتحت إعداد منطقة البئر، تعيين عدد المواقع داخل بئر ليكون صورة. ضمن إعدادات الحصول على الصور لـ GFP، قم بتعيين الجهاز على صورة البئر بالكامل مع وقت تعرض يبلغ 20 مللي ثانية لكل صورة. بالنسبة للضوء المنقول، احصل على صورة واحدة لمركز كل بئر مع وقت تعرض ثمانية ميلي ثانية.
بالنسبة للإيودينيوم، احصل على صورة واحدة في مركز كل بئر مع وقت التعرض 20 مللي ثانية. ثم قم بتأكيد الإعدادات في معلومات الإعدادات وانقر فوق موافق وقراءة لبدء التصوير. لإعداد مقياس مُنَتَسِر على فلورية عالي الإنتاجية للظروف المتساهلة للإصلاح، اغسل الخلايا مرتين بـ 200 ميكرولترات من 37 درجة مئوية M1 متوسطة لكل بئر وإضافة 100 ميكرولترات من 37 درجة مئوية M1 متوسطة طازجة مكمّلة بـ 30 يوديد بروفيديوم ميكرومولر بعد التخلص من الغسيل الثاني.
لإصلاح الظروف التقييدية، وغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولترات من 37 درجة مئوية M2 المتوسطة تكملها خمسة مللي EGTA في بئر تليها غسل واحد مع 200 ميكرولترات من M2 المتوسطة وحدها. بعد التخلص من الغسيل الثاني، إضافة 100 ميكرولترات من 37 درجة مئوية جديدة M2 المتوسطة تكملها 30 يوديد برودييوم ميكرومولار في بئر. ثم صورة لوحة تحت الضوء المنقولة، GFP، وPI كما أظهرت للتو.
في حين يجري تصوير لوحة، وضع 96 جولة جيدا أسفل البولي بروبلين microplate على الجليد وتكوين لوحة كما أظهرت للتو ل لوحة السابقة. لإصلاح شروط متساهلة، إضافة 100 ميكرولترات من الجليد البارد M1 المتوسطة تكملها 60 يوديد برودييوم ميكرومولار في بئر تليها إضافة 100 ميكرولترات من الجليد البارد M1 مع أو بدون 4X listeriolysin O في البئر. لإصلاح الظروف التقييدية، إضافة 100 microliters من الجليد الباردة M2 المتوسطة تكملها 60 ميكرومولار برودييوم يوديد في بئر تليها إضافة 100 ميكرولترات من الجليد البارد M2 مع أو بدون 4X listeriolysin O في البئر.
ويتحتم إعداد قائمة القوائم في التركيز التجريبي المناسب على الجليد قبل خمس دقائق تقريبا من بدء الفحص الحركي عندما تكون اللوحة الأولى على الجليد ويجري إعداد اللوحة الثانية. عند الانتهاء من اللوحة الأولى التصوير، على الفور نقل لوحة على ورقة من رقائق الألومنيوم على الجليد. بعد خمس دقائق، نقل 100 ميكرولترات من كل بئر من لوحة الثانية إلى بئر المقابلة المناسبة في لوحة تبريد الأولى، وإدراج نصائح ماصة تحت الغضروف المفصلي من الحل في كل بئر قبل إخراج وحدة التخزين دون خلط للتوزيع السليم للسموم.
السماح للسم لربط الخلايا المضيفة لمدة دقيقة واحدة ونقل على الفور لوحة الأولى إلى قارئ لوحة للم مقايسة ما بعد الحركية باستخدام وضع مقياس الطيف. في نهاية الفحص الحركي، الحصول على الفور تصوير ما بعد الحركية من لوحة الصورة كما هو موضح للتصوير قبل الحركية. لتحديد عدد الخلايا استناداً إلى الفلورسين النووية، في برنامج تعداد الخلايا المصغرة تحت الإعدادات، حدد إعادة التحليل، وفي إعدادات تحليل الصور، حدد تحليل كائن منفصل باستخدام 541 كطول موجي للعثور على الكائنات.
ضمن الخيار العثور على الكائنات، استخدم الرسم على طريقة العثور على الصور، حدد نوى، وانقر فوق تطبيق، ثم انقر فوق موافق وقراءة لبدء خوارزمية عد الخلايا. لا يتداخل تعبير GFP مع قياسات كثافة يوديدات البروديم في وجود أو عدم وجود علاج القوائم الطبية O. التعبير عن يوديد بروبديسيوم يمكن أن تنزف من خلال الفلوراسة GFP كما يتضح من زيادة في كثافة الفلورية GFP في خلايا H2B-GFP في تحليل التصوير بعد الحركة مقارنة مع التحليل قبل الحركية.
ولكن الأهم من ذلك، لا يؤثر هذا الانتقال على عد الخلايا، حيث أن عملية التجزئة التي تشارك في تعداد النوى لا تتأثر بزيادة في الفلورسيات GFP. في غياب الليسيريوليسين O، سلامة غشاء البلازما لا تزال ثابتة في وجود أو عدم وجود الكالسيوم خارج الخلية، في حين أن علاج ليستيريوليسين O في وجود الكالسيوم تكمل نتائج متوسطة في زيادة مطردة في كثافة الفلور البروديويد. في غياب الكالسيوم خارج الخلية ومع ذلك، هناك زيادة أكثر حدة بشكل ملحوظ في الفلوري اديوميد بروبديوم، مما يعكس عدم وجود إعادة الغشاء.
بدلا من ذلك، يمكن استبدال صبغة ربط حمض الكربوسيانين النووي مع الفلوريس في الأحمر البعيد من يوديد البرودينيوم لتقليل التداخل الطيفي مع GFP. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معامل الإثارة الأكبر للصبغة الحمراء البعيدة يعرض إشارة أعلى إلى نسبة الضوضاء ودقة أفضل بين الشروط التقييدية للإصلاح والإصلاح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، يوصى بتسمية جميع الأنابيب قبل يوم واحد من التجربة ، لأن هذا سيعدك لجميع إعداد الكاشف في يوم التجربة.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التصوير للخلايا للإجابة على أسئلة إضافية، مثل هل المسام تشكيل السموم تلف جميع الخلايا بشكل موحد أو بعض الخلايا أكثر عرضة من غيرها. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات الأمراض المعدية وإصلاح غشاء البلازما لاستكشاف آثار حجم المسام على كفاءة إصلاح أنواع الخلايا المختلفة.
