يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المجهر البصري، مثل كيفية التقاط صور فائقة الدقة بالإضافة إلى صور FRET باستخدام نفس المجهر. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن الجمع بين ثلاث وحدات التصوير المختلفة في مجهر واحد، والحد بشكل كبير من التكلفة الإجمالية. العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم تجميع مسار الإثارة.
أنها تتطلب اختيار صحيح من أجزاء والمحاذاة البصرية الحساسة. للبدء، قم بتثبيت بطاقة الحصول على البيانات من خلال واجهة PCI واستخدامها لتوصيل أجهزة الليزر بالكمبيوتر. التحكم في lasers'on وإيقاف السلوكيات بواسطة إنتاج منطق الترانزستور والترانزستور وتعديل الطاقة الخاصة بهم من قبل الإخراج التناظري لهذه البطاقة.
بعد ذلك، قم بإعداد جدول بصري معزول للاهتزاز مع مرايا ومقسمات شعاع كما هو موضح هنا وموصوف في بروتوكول النص المصاحب. الجمع بين أشعة الليزر في الألياف الضوئية وضع واحد من خلال تركيب أول لوحة محول الألياف في جبل ترجمة محور ض. بعد ذلك، قم بتركيب عدسة مزدوجة اللونية في لوحة قفص.
استخدام قضيب تمديد لتوصيل محول والعدسة لتشكيل قفص. ثم، استخدام بوصة واحدة وظائف البصرية سميكة لتركيب القفص على الجدول البصري. محاذاة الليزر 647 نانومتر عن طريق ضبط المكونات للحصول على أقصى انتاج الطاقة الليزر من خلال الألياف.
بمجرد الانتهاء من محاذاة الليزر الأول، تثبيت مؤقتا زوج من القزحيات ومحاذاة بقية الليزر واحدا تلو الآخر. تحقق من كفاءة المحاذاة لكل ليزر مع عداد الطاقة. تأكد من ترك واحدة القزحية أمام لوحة محول للحد من انعكاسات الليزر.
بعد ذلك، قم بتصميم عدسة التكبير وتثبيتها كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. من أجل خلق تأثير الاستجماتيزم اللازمة لاستخراج الإحداثيات ض من كل جزيء واحد، وضع عدسة 3D مع طول بؤري 10 متر في الكاسيت وإدراجه في مسار شعاع الانبعاثات. لتقليل الاهتزازات أثناء التصوير المتسلسل للتصوير المتسلسل للرائع المتعددة الألوان، استخدم مرشحات الانبعاثات الموضوعة في عجلة مرشحات حاجز متصلة بجانب المجهر.
للكشف المتزامن متعدد الألوان أثناء تجارب FRET أحادية الجزيء، ضع فلترًا آخر في مقسم الانبعاثات. لإعداد للتصوير محدودة الانعراج باستخدام الإثارة epi- الإثارة، أولاً ضبط زاوية الليزر الإثارة العرضية لوضع epi في ذراع الإضاءة. بعد ذلك، فك الارتباط عدسة 3D، وإدراج مكعب الالتفافية في مقسم الانبعاثات.
ثم، إدراج عدسة ماج لتوسيع الإضاءة. بمجرد إعداد، واتخاذ متعددة القنوات، Z-المكدس، و / أو الوقت المنقضي الصور من العينة الخاصة بك على أساس النتائج المرجوة. لإعداد الكشف متعدد الألوان جزيء واحد من الجزيئات التي شلت سطح، أولاً نقل عجلة التصفية إلى وضع فارغ.
هذا سيسمح لأشعة الليزر بالمرور. ثم، ضبط lasers'incidental زاوية الإثارة إلى زاوية العشب، وفك الارتباط على حد سواء ماج و 3D العدسات. بعد ذلك، قم بإشراك وضع القنوات الثلاث في مقسم الانبعاثات عن طريق استبدال مكعب الالتفافي أولاً بمكعب معايرة يسمح لجميع الضوء بالمرور عبر جميع القنوات.
ثم، تشغيل الكاميرا تحت DIC وضبط الفتحة من المقاين الانبعاثات حتى ثلاثة، قنوات منفصلة تماما تظهر على الشاشة. بدوره المقابض ضبط ضبط أفقي عمودي على مقسم الانبعاثات، ومحاذاة تقريبا القنوات الثلاث. بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل الكاميرا واستبدال مكعب المعايرة بالمكعب الثلاثي.
ضع عينة من حبات متعددة القنوات من 100 نانومتر. عند الإثارة في 488 نانومتر، الخرز متعدد القنوات 100 نانومتر تنبعث أطوال موجية مختلفة من الضوء، مما يتيح محاذاة ثلاث قنوات. ثم، بدوره على الكاميرا و488 نانومتر الليزر، والتكبير على واحدة من الخرز مشرق، وأخيرا محاذاة القنوات الثلاث عن طريق تحويل المقابض التحكم التكيف مرة أخرى.
مع عينة الآن في مكان، وذلك باستخدام ليزر ضعيفة، انتقل إلى منطقة مع كثافة بقعة معقولة وضبط قوة الليزر ووقت التعرض لتحقيق مقبولة إشارة إلى الضوضاء ومستويات photobleaching. ثم استخدم برنامج التصوير لالتقاط صور زمنية. للتصوير فائق الدقة، ابدأ بإدخال العدسة ثلاثية الأبعاد وإزالة العدسة الماغ.
ثم تحديد زاوية الليزر الإثارة الأمثل العرضية لتكون زاوية العشب. من أجل العثور على الارتفاع الهدف المناسب للتصوير ريال، استخدم التصوير DIC للعثور على المستوى الأوسط من الخلايا. تحديد المستوى حسب الارتفاع الذي تصبح فيه الخلايا شفافة.
بمجرد تحديد الطائرة البؤرية المطلوبة، ابدأ التصوير فائق الدقة. أثناء التصوير، قم بتغيير قوة الليزر 405 نانومتر للحفاظ على كثافة معقولة من البقع الوميض على. ابدأ التصوير بدون طاقة ليزر بنفسجية.
عد عدد البقع الوامضة في فترة معينة وزيادة طاقة الليزر البنفسجية بحيث يتم الاحتفاظ بعدد البقع الوامضة فوق عتبة العد المعرفة من قبل المستخدم في مجال العرض. تحليل البيانات عن طريق الكشف عن المركزيةات من كل بقعة في إطارات التصوير واستخراج قيم ض لكل بقعة من العاشر و س العرض. بناء صورة أعيد بناؤها وتصور الكائنات في 3D.
يسمح إعداد المجهر هذا بالتبديل المرن والقابل للاستنساخ بين طرق التصوير المختلفة، بما في ذلك التصوير التقليدي للقطع الضوئية، والتصوير فائق الدقة القائم على الكشف عن الجزيئات المفردة، والكشف متعدد الألوان عن الجزيء المفرد. من أجل الكشف عن التفاصيل الدقيقة في الجمعية الجزيئية ، يجمع المجهر فائق الدقة بين الآلاف من الصور مثل هذا. ثم يتم إعادة بناء هذه الصور لتوليد صورة نهائية فائقة الدقة.
تسمح تقنيات الدقة الفائقة بدقة مكانية عالية ، مما يوفر تفاصيل لا يمكن رؤيتها باستخدام تقنيات أخرى. وهذا ما تم إبرازه في الصورتين المعروضتين هنا. تظهر الصورة فائقة الدقة نفس RNase البكتيرية التنظيمية مثل صورة epifluorescence ولكنها تسمح باكتشاف جزيء واحد.
SmFRET هو طريقة أخرى قادرة على انجستروم إلى قرار نانومتر. هنا، تم تسمية جزيئات الحمض النووي الريبي المطوية بصبغة متبرعة خضراء وصبغة متقبلة حمراء. يمكن استخلاص مسارات كثافة الفلوريسنس من جزيئات فردية فردية، مما يولد كفاءة فريت كدالة للوقت.
لا تنس أن العمل مع الليزر يمكن أن تكون خطرة، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء حماية العين أو خفض القوى الليزر دائما حيث تنفيذ هذا الإجراء.
