نحن نصف هنا لأول مرة طريقة تسمح عالية الإنتاجية فحص المخدرات للمركبات senotherapeutic التي ثبت أن تكون مفيدة في الأمراض المرتبطة بالشيخوخة. في الواقع، العديد من التجارب السريرية مع الأدوية اختبار في هذا الجوهر جارية حاليا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التمييز بين نوعين من العقاقير senotherapeutic ، senolytics وsenomorphics ، باستخدام الكشف الراسخ من SA - بيتا غالاكتوسيداسي في الخلايا السنسنت.
هذه التقنية هي أداة فحص هامة للمركبات الرواية senotherapeutic. في الواقع، يتم عرض العديد من المركبات التي تم تحديدها بمساعدة هذه الشاشة في منشورات مختلفة رفيعة المستوى، وهي حاليا في التجارب السريرية. هذه التقنية متعددة للغاية ، ويمكن تكييفها مع العديد من الشاشات عالية الإنتاجية.
في الواقع ، من الممكن أن شاشات متعددة ، وشاشة للمركبات التي تقمع الشيخوخة عن طريق تنشيط أو تثبيط واحد من عدة مسارات. اِنقط كل جنين إلى قطعة ملليمتر واحد وأنبوبه صعودا وهبوطا عدة مرات. بعد ذلك، أضف 10 ملليلترات من متوسط النمو إلى أنسجة كل جنين.
لوحة لهم في طبق ثقافة 10 سنتيمترا، واحتضان في 37 درجة مئوية في 3٪ الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. واحتضان بقية كل جنين مع 0.25٪ تريبسين EDTA خليط لمدة 10 دقائق. لتجبيب الخلايا، أولاً، إزالة بعناية متوسط النمو وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من 1X PBS مرتين.
ثم، إضافة ملليلترين من 025 تريبسين EDTA حل للخلايا، واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك، قم بفحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من فصل الخلايا عن السطح. إضافة نفس المبلغ من متوسطة النمو لإنهاء عملية الهضم التربسين، ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي.
ثم، الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق. تجاهل المناط، وإضافة متوسطة نمو جديدة لإعادة تعليق الخلايا. بعد ذلك، عد الخلايا وبذرتها في لوحات جديدة في كثافة الخلايا المتوقعة.
بالنسبة إلى التفاضل الفرعي غير الشيخوخة، أولاً، تقسيم الخلايا المتقاربة بنسبة واحد إلى أربعة. ثم احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 3٪ الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتمديد لممر آخر. بعد ذلك ، للحث على خنائن الخلايا ، انقسمت البذور الخلايا الالتقاء من مرور واحد بنسبة واحد إلى أربعة وتحتضنها عند 37 درجة مئوية في 20 ٪ من الأكسجين و 5 ٪ بيئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام.
لمراقبة senescence الخلوية ، مع نظام متقدم Coulter خلية العداد ، وقياس الزيادة التدريجية في قطر الخلية وحجم الخلية خلال كل خطوة تريبسينية. لبدء اختبار فحص بيتا غال، بذور 5، 000 الخلايا السنسنت أو 3،000 الخلايا غير senescent في بئر في 96 لوحات جيدا. ثم، إضافة 100 ميكرولتردات من متوسطة النمو لكل بئر واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 20٪ من الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات.
بعد ذلك، إضافة تخفيف المخدرات إلى خلايا MEF واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 20٪ من الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 إلى 48 ساعة. بعد الحضانة، وإزالة محلول الدواء وغسل الخلايا مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني 1X. للحث على القلويات، قبل علاج الخلايا مع 90 ميكرولترات من محلول bafilomycin A1، المخفف في المتوسطة ثقافة الخلايا الطازجة بتركيز نهائي من 100 نانوموللار.
ثم، احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 20٪ من الأكسجين و 5٪ بيئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة. لتحليل الفلوريسنس من النشاط SA-بيتا غال، وجعل حل عمل جديد من C12FDG المخفف في متوسط النمو، في تركيز نهائي من 100 micromolar. ثم، إضافة 10 ميكرولترات من حل العمل إلى المتوسطة الثقافة في تركيز نهائي من 10 ميكرومولار، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 20٪ الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين.
غسل الخلايا مع 100 ميكرولترات من 1X PBS. بعد ذلك، أضف اثنين من ميكرولتر من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر هويشست 33342 صبغة في تركيز نهائي من اثنين من ميكروغرام لكل ملليلتر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 20٪ الأكسجين، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة.
بعد الحضانة، وإزالة وسائل الإعلام، إضافة 100 ميكرولترات من متوسطة النمو الطازجة، والمضي قدما في التصوير. في هذه الدراسة، سمحت منصة اقتناء وتحليل الصور الفلورية عالية المحتوى لتحديد الأدوية senolytic، مثل 17-DMAG، التي خفضت الأنشطة العامة SA-beta-Gal في ثقافات الخلايا الليفية الجنينية المورينية التي تحتوي على خلايا شيخوخة في مرور خمسة. التحليلات الكمية التي تولدها البرمجيات من خليط من الخلايا السنسنت وغير senescent تسمح لتدليل واضح من الآثار الخلية senescent محددة، والقضاء على خلفية بيتا galactosidase النشاط من قبل bafilomycin A.تأكد من تضمين جميع الضوابط اللازمة للخلايا، وخاصة الخلايا الحساسة غير المعالجة والخلايا senescent تعامل مع سيطرة إيجابية.
يتضمن هذا المقال العمل مع الخلايا الأولية تحت الأكسدة، والتي يمكن أن تؤدي إلى الاختلاف التي تحتاج إلى مراقبة. هذا الإجراء هو الخطوة الأولى في الكشف عن العقاقير senotherapeutic. تحتاج إلى تنفيذ قابلية الخلية للحياة الإضافية والمقالات الحساسة لتأكيد نتائج الفحص.
وقد تم الكشف عن العديد من الأدوية senolytic جديدة باستخدام هذا المقال، بما في ذلك أول مزيج المخدرات senolytic dasatinib quercetin، الحرارة صدمة البروتين 90 مثبطات، مثبطات الأسرة Bcl-2، وفيسيتين البوليفينول.
