يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة الوعائية مثل مراقبة ديناميكيات نمو الأوعية الدموية المهندس وإعادة عرضها خلال الثقافة على المدى الطويل. والميزة الرئيسية لاستخدام التصوير المقطعي الاتساق البصري، أو OCT، هو أنه هو متاح بسهولة، في الوقت الحقيقي واستراتيجية التصوير غير تدميري لتوصيف السمات الهيكلية وإعادة عرض عملية السفن المهندسة. وسوف يكون إثبات الإجراء أيضا شانغمين ليو، وينتاو ما، والفنيين من مختبري.
لبدء هذا الإجراء، تلفيق سقالة PGA كما هو موضح في بروتوكول النص Dip PGA السقالات في هيدروكسيد الصوديوم واحد مول لكل لتر لمدة دقيقة واحدة، لضبط الهيكل العتيق للشبكة. ثم، نقع السقالات في الأنسجة ثقافة الصف المياه ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منهما. في كل مرة، بات بلطف الجافة سقالة مع ورقة الأنسجة.
ثم جفف السقالات في غطاء محرك السيارة مع منفاخ لمدة ساعة واحدة. لتجميع مفاعل حيوي وتقاطع y لتصوير أكتوبر، أولا، نقع في مركز حيوي أسطواني الزجاج الذاتي المتقدمة، سقالات PGA، أنبوب سيليكون، أنابيب متوافقة مع البيولوجيا، موصلات، شريط اثارة، ومعدات للتجميع في خزان الإيثانول 95 في المئة لمدة ساعتين. اسحب سقالة PGA من خلال الذراعين الجانبيين للمُنْزع الحيوي المتصلة بجانب واحد مع موصل، وكذلك إلى جانب آخر مع تقاطع y المستخدم لتسليم سلك دليل OCT.
تجميع سقالة PGA آخر في مفاعل حيوي في نفس الطريق. تناسب اثيلين polytetrafluoro إلى شفاه مفاعل حيوي عن طريق تشديد عليه مع 4-0 الغرز. وضع مفاعل حيوي في خزان الإيثانول مرة أخرى لمدة ساعة واحدة قبل تجفيفه بين عشية وضحاها في غطاء محرك السيارة مع منفاخ على.
الآن، عزل الخلايا العضلية السلسة الشريان السري البشري من الشرايين السُرّية البشرية بواسطة تقنيات explant القياسية في سبب إنقاذ الخلايا في سقالات PGA، تجنب أي يقطر من تعليق الخلية على الجزء السفلي من مفاعل حيوي. أيضا، تغطية مفاعل حيوي مع غطاء سيليكون سدادة في أقرب وقت ممكن بعد الجلوس الخلية لمنع التلوث. توسيع والحفاظ على الخلايا في نمو العضلات على نحو سلس المتوسطة.
بذور الخلايا العضلية السلسة الشريان السري البشري بتركيز 5 ملايين خلية لكل ملليلتر في وسط الثقافة أعلاه على السقالات PGA. بعد وضع شريط السير في مفاعل حيوي، وتغطية غطاء سدادة السيليكون التي لديها أنبوب تغذية واحد وثلاثة شرائح أنابيب قصيرة إدراجها لتبادل الغاز. نعلق PTFE 0.22 ميكرون مرشحات لكل أنبوب تغيير الهواء، وإرفاق قبعة هيبارين واحدة إلى أنبوب التغذية.
اضبط شريط التحريك بسرعة تحريك 13 طلقة في الدقيقة. ثم، وتجميع الزجاج bioreactor، سيليكون سدادة غطاء، وسقالة PGA في نظام الثقافة. السماح للخلايا إلى التمسك لمدة 45 دقيقة من قبل يميل مفاعلات حيوية كل 15 دقيقة مع موقف إلى اليسار وإلى اليمين.
الآن، قم بتوصيل مضخة LOO-OH-YEE، كيس ملحي الفوسفات المخزن، والسائق مع أنابيب بيوليفية من أجل إنشاء نظام الإسراف. فتح برنامج التشغيل لملء الأنابيب مع برنامج تلفزيوني. ضع مفاعل الطاقة الحيوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.
ملء غرفة الثقافة مع 450 ملليلتر من الوسط ثقافة. زراعة السقالات المبذرة تحت ثقافة ثابتة لمدة أسبوع واحد، وتغيير المتوسطة الثقافة كل ثلاثة إلى أربعة أيام عن طريق الطامح نصف المتوسطة القديمة من خلال أنبوب التغذية وإعادة ملء المفاعل مع كمية مماثلة من متوسط الثقافة الطازجة. لإعداد نظام الإسراف لتصوير OCT ، ضخ السوائل في كيس PBS لتعميمها عبر الأنابيب القابلة للمناوب الحيوية والعودة إلى الحقيبة.
افتح قوة السائق ونظّم إعداد المضخة بتردد 60 نبضة في الدقيقة وضغط انقباضي ناتج 120 ملليمتراً من الزئبق. ضبط المعلمات الميكانيكية وفقا لاحتياجات الأنسجة هندسة زراعة الأوعية الدموية. انقر فوق زر التشغيل لجعل نظام الإسراف يعمل.
توفير محاكاة pulsatile الإصلاح للسفن لمدة ثلاثة أسابيع عن طريق الضغط المتكرر الأنابيب compatible بعد أسبوع واحد من الثقافة الساكنة. استخدام مصدر الضوء لضمان دقة محورية من 10 إلى عشرين ميكرون وعمق الصورة من ملليمتر واحد إلى اثنين ملليمتر لتحديد هيكل الأوعية الدموية التي هندسها الأنسجة، أو TEVBs، استنادا إلى مجال التردد نظام التصوير داخل الأوعية الدموية. قم بتشغيل مفتاح الطاقة وافتح برنامج التقاط الصور قم بتوصيل قسطرة تصوير الألياف البصرية بمحرك المحرك وتحكم التحكم البصري، مع وظيفة التراجع التلقائي للقسطرة.
تعيين معلمات معدل الحصول على الصورة إلى عشرة إطارات في الثانية، مع سرعة سحب تلقائية من عشرة ملليمترات في الثانية. الآن، قم بإرفاق قسطرة التصوير بمفرق y عبر قبعة الهيبارين بإبرة عيار 18. ضع القسطرة في أنبوب السيليكون وحدد ضيق الهيكل لشبكة PGA قبل تحميل سقالة PGA على المُدير الحيوي.
الآن، ضع طرف القسطرة على المنطقة ذات الأهمية. اضبط جهاز الانسحاب وتحقق من جودة الصورة. الحصول على الصور في واحد، أربعة، سبعة، عشرة، 14، 17، 21، و 28 يوما في الثقافة لكل TEBV الفردية.
حفظ هذه الصور بالتتابع مع مراقبة الوقت الحقيقي من البنية المجهرية TEBV بما في ذلك مورفولوجيا السطح، والبنية الداخلية، والتكوين. كرر القياس ثلاث مرات للحصول على قياس موثوق به للسفن المهندسة في كل مرة. التقط سلسلة من الصور خلال الاختبار باستخدام برنامج التقاط الصور.
لاستخدام برنامج تحليل الصور لقياس سمك جدار الأوعية الدموية الذي تم تصميمه بالأنسجة، حدد أولاً الصورة التي سيتم تحليلها. ثم، انقر فوق أداة التتبع لتحديد الجانب الداخلي للأوعية الدموية التي تم تصميمها بالأنسجة تلقائيًا مع البرنامج ورسم الجانب الخارجي يدويًا. سيظهر رسم تخطيطي للسمك على الشاشة.
كرر القياس لمدة خمس مرات للحصول على قياس موثوق به من الانشاءات. النظر في استخدام اثنين من المحققين المستقلين ملزمة للحصول على المعلومات. افتح غطاء سدادة السيليكون الموضوعة فوق المُصْدِر الحيوي عند الانتهاء من الثقافة، وتجاهل الوسيطة الثقافية.
تخفيف اثيلين متعددtetrafluoro من شفاه مفاعل حيوي وقطع أنابيب السيليكون من الجانب الخارجي من اثيلين polytetrafluoro مع مقص. حصاد TEBVs من مفاعل حيوي، وقطعها إلى أقسام لفحص المجهر المسح الإلكتروني. سحب أنبوب السيليكون الداعم، وإصلاح المقاطع مع 4 في المئة الفورمالديهايد السلطة.
قم بأداء التلطيخ النسيجي الروتيني مع أحمر ماسون الثلاثي اللون والصيرفة لفحص مورفولوجيا الكولاجين وPG. لتقييم محتوى PGA ومكون الكولاجين، لاحظ العينات الهستولوجية مع تلطيخ أحمر سيري من خلال مجهر مستقطب. تتم مقارنة صور OCT مع الاكتشافات الهستوولوجية لـ TEBVs بعد أربعة أسابيع من الثقافة.
تُظهر صورة OCT البنية المجهرية المدمجة ومكونات محددة مقارنة بالتقييم النسيجي. الاستزراع الوسيط، أنبوب السيليكون، TEBV، و جزء PGA مرئية. تلطّخ ماسون ثلاثية الألوان يوضح ألياف الكولاجين الموزعة في اتجاه معين، جنبا إلى جنب مع بقايا PGA في طبقة الوسائط من السفن المهندسة.
سيريوس الأحمر تلطيخ يكشف عن بقايا PGA ومكون الكولاجين باستخدام المجهر المستقطب. يُظهر المسح الإلكتروني المجهري للسفن المهندسة بنية صغيرة صغيرة. وفي الوقت نفسه، تعتمد طريقة التصوير داخل الغشاء هذه مراقبة غير تدميرية وسهلة لـ TEBVs، بما في ذلك عملية إعادة عرض وإعادة عرضها في الموقع الطبيعي في الثقافة طويلة الأمد.
كما هو مبين هنا، وإعادة عرض يحدث في وقت سابق والتغيرات المورفولوجية تظهر أكثر وضوحا في المجموعة الديناميكية من خلال مقارنة سمك TEBV. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين في مجال هندسة الأنسجة الوعائية لاستكشاف ميزات الهيكل وعملية إعادة عرض طويلة الأجل للسفن المهندسة. قد يكون العرض الواضح للبقايا البوليمرية بواسطة المجهر المستقطب جنبا إلى جنب مع التصوير OCT مفيدا لتقييم تدهور السقالة.
