يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ميكرورنا، من خلال توفير أدوات للكشف عن التكلس النسبي لكل من جزيئات البروتين والمجهر النوويRNA. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يمكنك الكشف عن كل من جزيئات البروتين والمجهر من نفس قسم الأنسجة. يبدأ هذا البروتوكول بإماهة الأنسجة المثبتة بالشريحة.
دافئة الشرائح في 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في فرن التهجين. يجب أن يكون البارافين يذوب بشكل واضح. ثم، احتضان الشرائح في جرة كوبلين الزجاج تحتوي على وكيل المقاصة المتاحة تجاريا لمدة 10 دقائق.
افعل هذا مرتين بعد ذلك، نقل الشرائح من غسل لغسل لإعادة الترطيب الأنسجة. مرة واحدة رطب، احتضان الأنسجة في محلول عمل البروتينات K في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
لإزالة البروتين K، قم بغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني 1x مرتين. الآن، إصلاح الأنسجة. أولاً، جعل الخزانات على الشرائح باستخدام قلم مبيد للماء لرسم دائرة طاردة للماء حول الاستعدادات.
بعد ذلك، تطبيق 500 ميكرولترات من 4٪ PFA حل داخل الحاجز، واحتضان الشرائح في غطاء محرك الدخان. لإزالة المثبت، قم بغسل الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على PBS لمدة خمس دقائق مرتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بغسل الشرائح في 0.13 مُضَر 1-ميثيليميدزول لمدة 10 دقائق.
القيام بذلك في غطاء محرك الدخان في درجة حرارة الغرفة، وإجراء هذا الغسيل مرتين. أضف تثبيت EDC، واحتضان في درجة حرارة الغرفة في غطاء أبخرة لمدة ساعة واحدة. شطف قبالة الشرائح مع تريس 50 ملليمولار.
للتحضير للتهجين، أولا بناء غرفة مرطبة. قم بتحميل قطعتين من ورق الفلتر أو الأنسجة في الجزء السفلي من مربع، وابتل الورق بمزيج واحد إلى واحد من الفورماميد و1x SSC. بعد ذلك، قم بتطبيق 200 ميكرولترات من محلول التهجين المدفأ مسبقًا على كل شريحة، وحضن غرفة الشرائح المرطبة لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات عند 50 درجة مئوية.
بعد الحضانة، استبدل حل التهجين بـ 250 ميكرولترات من محلول المسبار، وغطي الشرائح بزلة غلاف خالية من RNase. في محاولة لتجنب محاصرة فقاعات الهواء تحت زلة الغطاء. الآن، ختم بعناية الغرفة مع parafilm، واحتضان الشرائح بين عشية وضحاها في حوالي 30 درجة مئوية تحت درجة حرارة ذوبان الحمض النووي الريبي للمسبار.
قد يكون مطلوباً التحسين. بالإضافة إلى تحديد درجة حرارة الحضانة المناسبة ، يتم التعبير عن microRNAs مختلفة على مستويات مختلفة ، لذلك قد يكون مطلوبا أيضا التحسين فيما يتعلق بتركيز المسبار للحصول على الإشارة المثلى. بعد التهجين، قم بإجراء يغسل الصرامة.
أولاً، كان في 2x SSC في 50 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، أو حتى ينهز الغطاء. ثم قم بإجراء غسلين في 2x SSC في درجة حرارة الغرفة، كل لمدة خمس دقائق. ثم، الاستمرار في درجة حرارة الغرفة، وغسل الشرائح لمدة خمس دقائق في 0.2x SSC، تليها خمس دقائق في PBST، وأخيرا، خمس دقائق في برنامج تلفزيوني 1X.
عند هذه النقطة، والهجينة RNA-RNA مستقرة، والشروط RNA صارمة لم تعد هناك حاجة. للكشف عن الأجسام المضادة لحفر، أولا، لمس الحواجز hydrophobic، وتطبيق 500 ميكرولترات من محلول الحجب لمدة ثلاثين دقيقة. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
بعد ذلك، قم بإزالة حل الحجب واستبدله بـ 500 ميكرولترات من محلول DIG المضاد. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطب لمدة ساعة. ثم، باستخدام الجرار كوبلين، وغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل.
بعد ذلك، قم بغسل الشرائح في محلول ما قبل التلطخ لمدة خمس دقائق مرتين. ثم، نقل الشرائح إلى جرة بريد شريحة البولي بروبلين، وإضافة 20 ملليلتر من حل الركيزة AP. الآن، احتضان الشرائح في 37 درجة مئوية لمدة ست إلى 24 ساعة، محمية من الضوء.
عند استخدام الركيزة AP لأول مرة ، من المهم متابعة التفاعل. على فترات لمدة ساعتين، تحقق من تطور الألوان على الشرائح باستخدام المجهر، حتى يتم تحديد وقت الحضانة الأمثل. لإزالة الركيزة AP الزائدة، وغسل الشرائح مرتين في حل KTBT لمدة خمس دقائق لكل غسل، تليها غسل واحد في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق.
للكشف عن الأجسام المضادة cTNT، أولا، كتلة الأنسجة لمدة ساعة. ثم، تطبيق 200 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة cTNT، واحتضان الشرائح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في غرفة مرطب. في اليوم التالي، غسل الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق.
افعل هذا ثلاث مرات ثم، تطبيق 250 ميكرولترات من المضادة للأرانب 568 حل الأجسام المضادة، واحتضان الشرائح لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطب. لغسل الأجسام المضادة الثانوية الزائدة، استخدم ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS.
ثم، إذا رغبت في ذلك، وتطبيق 250 ميكرولتررس من حل العمل DAPI، واحتضان الشرائح لمدة دقيقة واحدة، محمية من الضوء. لإزالة بقعة DAPI الزائدة، استخدم اثنين من خمس دقائق PBS يغسل، وبعد يغسل، تحميل الشرائح. تم تحسين التهجين MicroRNA في الموقع على أقسام قلب الماوس باستخدام ميكرورنا مخفوق للسيطرة السلبية ، و U6 snRNA كتحكم إيجابي.
تم تقييم التعبير الخاص بـ Cardiomyocyte من ميكرورنا-182 في أقسام القلب من التحكم والفئران المفرطة في التعبير عن PlGF. حملت الفئران transgene PlGF تحت المروج ألفا MHC، وتطوير تضخم القلب، والثانوية لزيادة تولد الأوعية، في غضون ستة أسابيع من تنشيط transgene. وكشف بروتوكول تلطيخ زيادة التعبير عن ميكرورنا-182 في قلوب الفئران PlGF.
بعد ذلك ، لتحديد أنواع الخلايا التي أعرب عنها ميكرورنا - 182 ، كانت نفس الأقسام مُعَمنة لـ cTNT. كما تم استخدام تلطيخ DAPI. في كل من أقسام القلب الماوس التحكم وPlGF, تم العثور على ميكرورنا-182 في المقصورة النووية من خلايا القلب القلبية إيجابية cTNT.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ التهجين microRNAse، تليها مناعة البروتين. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم جداً أن نتذكر أن تبقي الظروف خالية من RNAse طوال اليوم الأول، خلال جميع الخطوات المؤدية إلى التهجين الدعامة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل لطخة الغربية في PCR في الوقت الحقيقي للإجابة على أسئلة مثل، ما هي مستويات التعبير النسبية لهذا ميكرورنا خاصة في الأنسجة المختلفة، أو هذا البروتين خاصة في نفس القسم الأنسجة.
لا ننسى أن العمل مع المثبتات مثل PFA وADC يمكن أن تكون خطرة للغاية. الاحتياطات, وتشمل ارتداء القفازات والمعاطف المختبر, وكذلك استخدام أغطية الدخان, وينبغي دائما أن تتخذ عند تنفيذ هذا الإجراء.
