Name: a method for targeted 16s sequencing of human milk samples
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples at JoVE.com

نود أن نشكر هيلتي أديسيتييو، دكتوراه، وشانجكسين يانغ، دكتوراه لتطوير البروتوكول. وقدمت الدعم الشامل للدولي الأمهات طب الأطفال المراهقين الإيدز السريرية المحاكمات المجموعة (إيمباكت) "المعهد الوطني للحساسية" والأمراض المعدية (نييد) من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ضمن "أرقام جائزة" UM1AI068632 (خط إيمباكت)، UM1AI068616 (إيمباكت سدمك) و UM1AI106716 (LC إيمباكت)، بتمويل مشترك من يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) والمعهد الوطني للصحة العقلية (NIMH). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

<ol>
	<li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system.">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li><li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Holobiont:+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System.">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental,+tongue,+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity.">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).</li><li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome.">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).</li><li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects:+Tools,+techniques,+and+challenges.">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li><li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+human+microbiome+research.">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research.">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52 (2017).</li><li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing:+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing.">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561 (2017).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome.">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li><li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study.">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li><li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk.">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li><li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8(+)+T+cells+in+human+breast+milk.">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li><li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women.">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li><li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li><li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+DNA/RNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses.">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588 (2016).</li><li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants.">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).</li><li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease.">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li><li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota.">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29 (2016).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87 (2014).</li><li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice.">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26 (2015).</li><li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples.">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24 (2016).</li><li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles.">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies.">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).</li><li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+human+lower+airways:+a+next+generation+sequencing+perspective.">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).</li><li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract.">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li><li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing.">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).</li><li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data.">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19 (2015).</li><li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking.">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li><li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR.">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73 (2016).</li><li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genetics+and+Gut+Microbiome:+Challenges+and+Perspectives.">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li><li>. Mock microbial communities Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017)</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

تستهدف الجيل التالي تسلسل الرنا الريباسي 16S تقنية تستخدم على نطاق واسع وسريع ل توصيف ميكروبيومي18. ومع ذلك، العديد من العوامل، بما في ذلك الآثار دفعة والتلوث البيئي، والتلوث عبر العينة، حساسية وإمكانية تكرار نتائج يمكن أن تضر بالنتائج التجريبية وارباك على تفسير7،19 , 20-يجب أن تتضمن ميكروبيومي مهام سير العمل لتسهيل أفضل التحليلات 16S قوية، جيدة التصميم التجريبي، استخدام عناصر تحكم مناسبة الفصل المكاني لخطوات سير العمل، وتطبيق أفضل الممارسات. ويتضمن كل من هذه المعلمات البروتوكول الموصوفة هنا ويوفر الأدوات التجريبية الهامة التصدي للتحديات المذكورة أعلاه وتنفيذ سير عمل 16S لعينات مختلفة.
جيدة التصميم التجريبي حاسم بالنسبة لتحليلات ميكروبيومي 16S. ويشمل هذا جمع المناسب وتخزين العينات، وكذلك اختيار 16S الإشعال المناسبة للمنطقة لمصلحة. على سبيل المثال، يتم تحديد منطقة V4 (515F/806R) اللبن البشري لأنها التضخيم جيدة من البيفيدوباكتريا، التي تلعب دوراً هاما في التنمية من القناة الهضمية الولدان ميكروبيومي21. مجموعات التمهيدي الأخرى (مثلاً، 27 واو/338R، 515F/926R) قد تكون أكثر ملاءمة لإجراء دراسات لسائر المجتمعات الميكروبية. ملاحظة هامة الصلب درجة الحرارة ل 16S المستهدفة بكر وحجم amplicon المتوقعة قد تختلف استناداً إلى التحديد التمهيدي.
أماكن أخرى قد يتم تعديل البروتوكول تستند إلى نتائج الخطوات مراقبة الجودة التي أدرجت في سير العمل. وهناك خيارات قليلة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها عند اكتشاف الحمض النووي أما لا يوجد أو قليلاً بعد الخطوة التضخيم بكر 16S المستهدفة. 1 يمكن وضع) عينة من خلال خطوة إزالة المانع PCR. التضخيم التالية إزالة المانع PCR باستخدام مجموعة خطوة واحدة يؤديها كل البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة بنجاح ما يقرب من 40 في المائة الوقت، 2) أكثر استخراج الحمض النووي يمكن أن تضاف إلى 16S المستهدفة بكر، أو 3) جديدة ويحتمل أن تكون أكبر يمكن معالجة قاسمة للحليب إذا كانت متوفرة. إذا كان هناك قلق بشأن منتجات PCR خارج نطاق الحجم المتوقع بعد تنقية السليكا-المستندة إلى غشاء من المكتبة، يمكن إضافة خطوة تنقية هلام. وأخيراً، خطوات مراقبة الجودة حاسمة لتحديد ما إذا كان هناك دليل على التلوث، والتي نوقشت بالتفصيل أدناه. إذا تم الكشف عن تلوث كبير، ثم الاعتماد التي أدخلت فيها التلوث، أما بكر يمكن أن تتكرر، أو إذا لزم الأمر، يمكن إعادة استخراج العينة. لحسن الحظ، مع الممارسات المختبرية الجيدة، وهذه هي الأحداث النادرة. أخيرا، بينما تتم كتابة هذا البروتوكول لتسليط الضوء على المحاذير في التضخيم العينات منخفضة الكتلة الأحيائية واللبن البشري على وجه التحديد، يمكن بسهولة تعديل البروتوكول للتضخيم مسحات الفم والمستقيم والمهبل والجلد أو الأسفنج، فضلا عن البراز. إذا كان يتم اختيار أنواع العينات الأخرى، ثم النظر التي مجموعات الاستخراج الأمثل لنوع عينة محددة.
آثار دفعة بسبب مجموعات أو الكواشف أو تشغيل تسلسل تشكل مصادر هامة لتقلب في الدراسات ميكروبيومي. معدات استخراج الحمض النووي، جنبا إلى جنب مع سائر المواد الكاشفة، تملك مستويات منخفضة من الحمض النووي البكتيري، والتي قد تختلف إلى حد كبير بالكثير20،22،،من2324. تحديد مجموعات مصممة للتقليل من التلوث بمواد لمشروع كبير، استخدام الكثير واحدة من مجموعات، الكواشف، قد تبسيط تحليل7. تتم معالجة العينات للمواضيع والضوابط جنبا إلى جنب. فمن الأفضل إذا كانت جميع العينات لدراسة واحدة، كل موضوع والتحكم، ويمكن إدراجها في تسلسل واحد تشغيل. إذا كان عدد كبير من العينات بحيث تتم معالجتها على دفعات، عينات تمثيلية للمواضيع والضوابط المدرجة في كل دفعة ومعالجتها معا. من المهم أيضا لتنظيم تجهيز الدفعات للتقليل من تلوث العينات منخفضة-الكتلة الحيوية (أي، لبن) من العينات التي هي عالية الكتلة الحيوية (أي، البراز). وفي مثل هذه الحالات، عملية انخفاض الكتلة الأحيائية عينة أنواع الكتلة الحيوية الأولى ومن ثم ارتفاع عينات للدراسة نفسها.
عينات منخفضة الكتلة الحيوية تشكل تحديات فريدة من نوعها للدراسات ميكروبيومي، كالتلوث من البيئة، الكواشف، والصكوك، والباحث يمكن أن تجعل من الصعب التمييز بين أفراد المجتمع الأصيلة في وفرة منخفضة7 , 25 , 26 وتلك التي يتم تقديمها بشكل مصطنع للعينة من خلال عملية تجريبية19. يتضمن سير العمل الموضحة هنا أهمية الضوابط السلبية التجريبية في كل خطوة إعداد عينة (تحلل المخزن المؤقت فقط التحكم)، والخطوة بكر (مراقبة المياه PCR) (انظر الشكل 4). عناصر التحكم هذه المساعدة في تحديد مصادر التلوث وتيسير تدابير تصحيحية فعالة على مقاعد البدلاء أو في السيليكون27،،من2829،30. عناصر سلبية بعناية تقييم وأفادت بأن نتائج الدراسة7.
للتقليل من التلوث، المهم الفصل المكاني للأنشطة التجريبية إلى التضخيم PCR قبل تنظيف المنطقة والمنطقة بعد التضخيم. على النحو الأمثل، غرفة نظيفة بكل منطقة لإعداد مزيج سيد بكر وإعداد نموذج/إضافة للماجستير مزيج المنطقة، ويمكن إدراج مربع منفصل قتلى جوية أو خزانة سلامة بيولوجية مساكن مخصصة من المواد الاستهلاكية والمعدات الصغيرة اللازمة إعداد مزيج الرئيسي. ويتضمن تصميم غرفة نظيفة نظام تدفق الهواء إيجابي مع تنقية الهواء جسيمات (HEPA) عالية الكفاءة. استخدام معدات الوقاية الشخصية أمر ضروري للحفاظ على بيئة منخفضة للميكروبات التي تسيطر عليها، ويشمل هيرنيتس، مختبر المعاطف، القفازات، والأحذية ويغطي. مجموعات/الكواشف وعينات مثالي مخزنة في ثلاجات/مجمدات مخصصة منفصلة. الإعداد PCR تجري أيضا في غرفة نظيفة في محطات العمل المعينة؛ هو الإبقاء على الفصل الواضح بين الأرصدة التمهيدي والكاشفات من الحمض النووي المستخرج حتى يتم تحميل عينات على منصة بيبيتينج الآلي. بمجرد اكتمال إعداد بكر، اللوحة نقله إلى منطقة ما بعد التضخيم وتحميلها على cycler حرارية.
من المهم تقييد تدفق نشاط العمل من المناطق النظيفة إلى المناطق التضخيم فيما بعد؛ هناك لا حركة تراجعية من الكواشف أو الصكوك أو إمدادات من مناطق التضخيم فيما بعد إلى منطقة نظيفة. الأفراد التي دخلت أي مجال من مجالات ما بعد التضخيم ممنوعون من الدخول إلى منطقة نظيفة لمدة 24 ساعة (حتى اليوم التالي). بالإضافة إلى الاعتبارات المذكورة أعلاه في سير العمل، يجب تنفيذ تنظيف البروتوكولات في المناطق النظيفة والتضخيم فيما بعد لتقليل التلوث الحمض النووي من أسطح العمل والأجهزة. إذا كانت الحواجز المادية أو غرف منفصلة غير ممكن، ويجب بذل كافة الجهود لإعداد العمل في مناطق متباعدة قدر الإمكان.
بالإضافة إلى التلوث، وتحدي ميكروبيومي دراسات الحساسية وتقلب، وإمكانية تكرار نتائج31. هذه عناوين بروتوكول هذه القضايا من خلال دمج معرفة مجتمع صورية بكتيرية التي يتم استخراجها، تضخيم، والتسلسل جنبا إلى جنب مع كل دفعة من عينات (انظر الشكل 4 باء). عنصر التحكم هذا يوفر مرجع داخلية مستمرة التي تقوم بتقييم إمكانية تكرار نتائج النتائج التجريبية التي تم إنشاؤها، ويمكن استخدامها لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها التي تنشأ. على سبيل المثال، يمكن أن توفر نوعية الحمض النووي المستخرج صورية متري لتحلل عينة فعالة واستخراج الحمض النووي، يغيب فيها عناصر الحمض النووي الجينوم. يمكن أيضا الإشارة إلى مراقبة جودة أمبليكونس PCR للعينة صورية PCR الكفاءة والدقة. وعلاوة على ذلك، نظراً لأن الصورية تضم العديد من أنواع البكتيريا، يمكن أن يستدل الحساسية النسبية لدفعة مجهزة من العينات بالتمثيل للأصناف في تسلسل نتائج العينة صورية. جماعة صورية مثالية ستقوم بتقييم القدرة على الكشف عن الأنواع البكتيرية الرئيسية في حجرة يجري تحليله، وذلك التكوين للمجتمع الصورية قد تحتاج إلى تختلف بحسب الدراسة. كما هو موضح في الشكل 4 أ، وهناك تباين كبير بين نتائج العينة التسلسل، ولكن نتائج التسلسل للمجتمع الصورية البكتيرية يتم استنساخه بدرجة عالية (انظر الشكل 4 باء).
بينما للمجتمع الصورية في الشكل 4 مزيج فريد من سلالات 33 من مزيج من يعزل السريرية المتاحة تجارياً والمحلية، مجتمع صورية متاحة تجارياً في الآونة الأخيرة نمواً32.
على الرغم من محدودية قدرتها على نطاق واسع عنوان إمكانية تكرار نتائج سير العمل الموضحة هنا عبر دراسات مختلفة ميكروبيومي، أنه يوفر نهج تجريبي هام يسمح الباحثين دمج المناسبة التجريبية عناصر التحكم ورصد إمكانية تكرار نتائج إطار النتائج الخاصة بها.

يعتقد أن المجتمعات الميكروبية التي استعمار البشر أن تكون الأهمية لصحة الإنسان، والأمراض التي تؤثر على الأيض والتنمية محصنة والتعرض للمرض، والردود على التطعيم والمخدرات العلاج1، 2-التأكيد على الجهود المبذولة لفهم تأثير الحجمية على صحة الإنسان حاليا تحديد الميكروبات المرتبطة بالمكونات التشريحية المحددة (أي، الجلد، الأمعاء، عن طريق الفم، إلخ)، فضلا عن مواقع محلية داخل هذه المقصورات3،4. التي تدعم هذه الجهود التحقيق هو الظهور السريع، وزيادة إمكانية الحصول على تكنولوجيات الجيل التالي التسلسل (خ ع) التي توفر منصة موازية على نطاق واسع لتحليل محتوى الجينية الميكروبية (ميكروبيومي) من عينة. للعديد من عينات الفسيولوجية، ميكروبيومي المرتبطة بها على حد سواء معقدة ووفرة (أيالبراز)، ولكن لبعض العينات، ممثلة في ميكروبيومي بانخفاض الكتلة الحيوية الميكروبية (أي، واللبن البشري، والجهاز التنفسي السفلي) حيث حساسية والتحف الفنية التجريبية، والتلوث المحتمل تصبح القضايا الرئيسية. التحديات المشتركة في الدراسات ميكروبيومي والتصميم التجريبي المناسب قد خضعت متعددة استعراض المواد5،6،،من78.
المقدمة في هذه الوثيقة هو خط أنابيب تجريبية قوية خ ع استناداً إلى المستهدفة تسلسل الرنا الريباسي 16S V4 المنطقة9 تميز ميكروبيومي اللبن البشري. التحليل ميكروبيومي اللبن البشري معقدة ليس فقط طبيعتها منخفضة الكتلة الحيوية الميكروبية10، بل بالإضافة إلى ذلك بارتفاع مستويات الحمض النووي البشري الخلفية11،12،،من1314 و احتمال ترحيل PCR مثبطات15،16 في الحمض النووي المستخرج. يعتمد هذا البروتوكول على مجموعات استخراج المتاحة تجارياً ومنصات شبه الآلية التي يمكن أن تساعد في تقليل التغير عبر نموذج إعداد دفعات. ويضم مجتمع صورية بكتيرية المعالم التي يتم معالجتها جنبا إلى جنب مع عينات كعنصر تحكم الجودة للتحقق من صحة كل خطوة في البروتوكول، وتوفير مقياس مستقل من متانة الأنابيب. ورغم أن البروتوكول كوصف محدد لعينات اللبن البشري، وهو القابلة للتكييف وفقا لأنواع العينة الأخرى بما في ذلك البراز، المستقيم، المهبل، والجلد، ومسحات أريولار، وعن طريق الفم10،17، ويمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق الباحثين الذين يرغبون في إجراء تحليلات ميكروبيومي.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>DNA/RNA extraction kit</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, DNA decontaminant</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature-controlled vortexer</td></tr><tr><td>Buffer RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td></tr><tr><td>&amp;szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&amp;szlig;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>bead tube</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>automated sample disruptor adapter set</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>QIAgen RB tube</td><td></td><td></td><td>manufacturer&#039;s microcentrifuge tube in kit</td></tr><tr><td>QIAcube and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>automated DNA/RNA purification instrument</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>non-enzymatic decontamination solution</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>elution buffer</td></tr><tr><td>QIAgility and related plasticware</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>robotic liquid handler</td></tr><tr><td>PCR water</td><td>MO BIO</td><td>17000-</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Barcoded reverse primers</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>designed and ordered</td></tr><tr><td>96 well PCR plate</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 and related plasticware</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td></tr><tr><td>D1000 reagents for Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td></tr><tr><td>OneStep PCR Inhibitor Removal Kit</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#039;s instructions.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>microvolume spectrophotometer</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #&#039;s</td><td>next generation sequencer</td></tr></tbody></table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

وقد أصبحت دراسات المجتمعات الميكروبية على نطاق واسع مع وضع تسلسل غير مكلفة نسبيا والسريع، وارتفاع الإنتاجية. ومع ذلك، كما هو الحال مع جميع هذه التكنولوجيات، تعتمد النتائج استنساخه على سير عمل مختبر الذي يشتمل على الاحتياطات اللازمة والضوابط. وهذا أهمية خاصة مع العينات منخفضة-الكتلة الحيوية حيث تلويث الحمض النووي البكتيري يمكن أن تولد نتائج مضللة. هذه المادة تفاصيل سير شبه الآلي التعرف على الميكروبات من عينات حليب الثدي البشري استخدام تسلسل المستهدفة من منطقة V4 الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) 16S على نطاق throughput منخفضة إلى متوسطة. وصف البروتوكول إعداد عينة من الحليب الكامل الدسم بما في ذلك: عينة تحلل، واستخراج الحمض النووي، والتضخيم من منطقة V4 16S الرنا الريباسي الجينات، وإعداد مكتبة بتدابير مراقبة الجودة. الأهم من ذلك، البروتوكول والمناقشة النظر في القضايا التي البارزة في إعداد وتحليل العينات منخفضة-الكتلة الحيوية بما في ذلك الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية، وإزالة المانع بكر، تلوث العينة بالبيئية، الكاشف، أو مصادر تجريبية، وأفضل الممارسات التجريبية الرامية إلى ضمان إمكانية تكرار نتائج. حين البروتوكول كما هو موضح محددة لعينات اللبن البشري، أنها قابلة للتكيف للعديد من أنواع عينة الكتلة الأحيائية المنخفضة والعالية، بما في ذلك عينات جمعت في مسحات، مجمدة نظيفة، أو استقر في المخزن مؤقت الحفاظ على.

ويشمل البروتوكول المعروضة هنا خطوات مهمة مراقبة الجودة (مراقبة الجودة) لضمان أن تجتمع البيانات التي تم إنشاؤها بالنقاط المرجعية لبروتوكول التحكم حساسية وخصوصية، والتلوث. يتبع الأول QC خطوة البروتوكول [بكر] تضخيم المنطقة V4 16S (الشكل 2). ميليلتر واحد من المنتج بكر من كل عينة تم تحليلها بواسطة التفريد لتأكيد أنه من ضمن نطاق الحجم المتوقع من 315-450 bp (الشكل 2، سهم أحمر). بعض عينات اللبن البشري تولد كميات أقل من منتج معين (الشكل 2A، قارن الممرات 3 و 9-11 مع الممرات 4-8)، مما يوحي أما المستويات المنخفضة لاستخراج الحمض النووي الميكروبي في تلك العينات، أو الرصيد المرحل من مثبطات بكر أثناء استخراج. للعينات التي تنتج أقل من 2.0 شمال البحر الأبيض المتوسط للمنتج في مجموعة بريتيش بتروليوم 315-450 (الشكل 2A، لين 7)، بكر مثبط لتنظيف هو قام باستخدام عدة خطوة واحدة والعينة إعادة تضخيم. معدلات نجاح الاسترداد للتضخيم عينة بعد تنظيف حوالي 40%. كوانتيتيشن لمنتج معين لكل عينة (الشكل 2) أمر ضروري لتحديد حجم المطلوبة لتجميع المولى متساوية من عينات للتسلسل. مكتبة مجمعة لتسلسل المستهدفة عادة ما تهيمن على منتج PCR محددة (الشكل 3). إذا لم يكن هناك كمية كبيرة من المنتجات غير محددة في المكتبة، خطوة تنقية هلام ينبغي أن تضاف إلى سير العمل.
في المثال في الشكل 2 ألف، لوحظت العصابات باهتة لعناصر المخزن المؤقت (قبل الميلاد؛ ممرات 2 و 12) وبكر المياه مراقبة سلبية (PC؛ لين 1)، تشير إلى تلوث البيئة أو الكاشف ممكن. هذه العصابات ليست مستغربة، وعادة ما تمثل كميات قليلة من المنتج بكر (أي< 1 نانومتر) وإنتاج بعض التهم قراءة أثناء تسلسل (< 1,000). وتؤكد النتائج تسلسل الممثل (الشكل 4) وفي الواقع أن هذه العينات منخفضة جداً تسلسل قراءة التهم (الشكل 4A، الممرات 1 و 11؛ الممرات الشكل 4Bوالمخزن والمياه PCR)، والأهم من ذلك تكوين الأصناف لعينات مراقبة متميزة من عينات اللبن البشري (الشكل 4A؛ والممرات مقارنة 1 و 11 مع الممرات 2-10). وتقترح التهم قراءة عالية في عناصر سلبية، جنبا إلى جنب مع تداخل كبير في تكوين الأصناف بين الضوابط وعينات، والتلوث عبر والحاجة لمراقبة التلوث بتحسين.
نتائج التسلسل (الشكل 4) تدل على التنوع الكبير في الأنواع المرتبطة ميكروبيومي اللبن البشري وتقلبه في عدد تسلسل قراءة التهم لكل عينة (الشكل 4A، الممرات 2-10). وفي المقابل، أثبتت تكوين الأصناف نتائج التسلسل للبكتريا الزائفة التي تمت معالجتها جنبا إلى جنب مع عينات اللبن البشري وقراءة التهم التي كانت مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها الصورية في تشغيل سير العمل السابق (قارن الشكل 4A ، لين 12 مع الشكل 4B، ممرات وهمية). نتائج متسقة لممرات وهمية توحي بأن التغير الملحوظ لعينات اللبن البشري نتيجة تجريبية أصيلة، وليست دالة للتغيرات الجوهرية في سير العمل.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56974/56974fig1.jpg"> رقم 1: مخطط تدفق أنابيب التسلسل 16S المستهدفة. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56974/56974fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56974/56974fig2.jpg"> رقم 2: تحليل مراقبة الجودة 16S V4 أمبليكونس. (أ) صورة جل 16S V4 أمبليكونس حل بالتفريد استخدام محلل بلغة الحمض النووي/رنا الآلي. تم إنشاء أمبليكونس V4 16S وفقا كابوراسو et al. وقد تم تحليل 9وميليلتر واحد لكل منتج PCR استخدام كواشف الحمض النووي حساسية عالية طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. إنتاج عينات اللبن البشري الأكثر (الممرات 3-6 و 8-11) وصورية البكتيرية (لين 13) منتج PCR الأولية في الحجم المتوقع لحوالي 400 شركة بريتيش بتروليوم (السهم الأحمر). عينة اللبن البشري في حارة 7 فشل لإنتاج كميات كبيرة من منتج معين وتخضع لتنظيف وإعادة التضخيم. تم الكشف عن منتج الحد الأدنى لمراقبة PCR سلبي (PC، لين 1)، وتحلل عناصر سلبية المخزن المؤقت (قبل الميلاد، ممرات 2 و 12) أشار إلى الحد الأدنى من التلوث الموجودة في العينات التي تم تحليلها. ميغاواط، علامات الوزن الجزيئي: الزاوية الحمراء وانخفاض أشرطة خضراء التعرف 1,500 bp وشركة بريتيش بتروليوم 25 حجم علامات، على التوالي، في كل حارة. (ب) "أعلى اليكتروفيروجرام" لين 3 من جل في (ألف). المنتج بكر الابتدائي يقع داخل منطقة ذروة المعرفة بأشرطة عمودية حمراء ويضم الشظايا التي يتراوح حجمها بين 299-497 bp أسفر عن حجم منتج بكر متوسط من 396 هناك Gating يتم على نطاق أوسع قليلاً من حجم amplicon المتوقعة (ط ن هذه القضية bp 315-450) للتأكد من تضمين الذروة عينة كاملة. ربط قمم العلوي والسفلي مع أحجام جزء من 25 شركة بريتيش بتروليوم و 1500 شركة بريتيش بتروليوم، على التوالي. السفلي: مخطط يلخص حجم المعلمات لمنطقة الذروة وتركيز المنتج بكر داخل منطقة ذروة في نانوغرام/ميليلتر، ومولاريتي في شمال البحر الأبيض المتوسط لمنتج PCR المحددة. ثم يتم استخدام هذه المعلومات لحساب كم سوف تجمع كل عينة في مكتبة مولى مساوية للتسلسل (انظر نموذج الحساب). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56974/56974fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56974/56974fig3.jpg"> الشكل 3: اليكتروفيروجرام مكتبة تسلسل مجمعة ومركزة. تم ضم كميات متساوية المولى للعينات الفردية تكون متسلسلة إلى مكتبة مجمع. المكتبة ثم تنظيفها ومركزة لإجمالي حجم 50 ميليلتر استخدام بكر السليكا-المستندة إلى غشاء تنظيف كيت. وأجريت الاستعدادات النهائية للمكتبة للتسلسل في التسلسل الجيل القادم وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. كان تسلسل هذه المكتبة بنجاح على الرغم من وجود نطاقات إضافية. إذا كان هناك قلق بشأن منتجات PCR خارج نطاق الحجم المتوقع، والبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة تقترح إضافة خطوة اختيار حجم هلام. لم يتم تنفيذ هذه الخطوة QC عادة. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56974/56974fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56974/56974fig4.jpg"> الشكل 4: تقييم عناصر سلبية وإيجابية. (أ) وفرة نسبية من الأنواع البكتيرية من دفعة الاستخراج مع عينات اللبن البشري وعناصر التحكم. كتدبير من تدابير مراقبة الجودة، تتولد تركيبة من كل دفعة استخراج كما حملت على الصك تنقية الحمض النووي/رنا الآلي فور تشغيل تسلسل. الأرقام تحت كل عينة شريط تشير إلى عدد القراءات التي تمت تصفيتها للعينة الخاصة بكل منها. التراكيب عناصر المخزن المؤقت مميزة عن عينات اللبن البشري. (ب) وفرة نسبية من الأنواع البكتيرية في المخزن المؤقت، وهمية، وضوابط PCR. يتم تقييم عدد القراءات وتكوينها لجميع عناصر إيجابية (البكتيريا صورية) وسلبية (المخزن المؤقت والمياه PCR). تختلف التراكيب المخزن المؤقت والمياه، ولكن المجتمع وهمية لا يزال مستقرا تماما. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56974/56974fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples at JoVE.com

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

ويرد سير شبه الآلي لتسلسل الرنا الريباسي 16S من اللبن البشري وأنواع العينة منخفض-الكتلة الأحيائية الأخرى المستهدفة.

أسلوب لتسلسل 16S المستهدفة من عينات اللبن البشري

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K Views.  University of California at Los Angeles. ويرد سير شبه الآلي لتسلسل الرنا الريباسي 16S من اللبن البشري وأنواع العينة منخفض-الكتلة الأحيائية الأخرى المستهدفة.

Video: A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

عزل وتكاثر وتحديد الأنواع البكتيرية ذات خصائص استقلاب الهيدروكربون من الموائل المائية

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Environment

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

تحديد مسببات الأمراض البكتيرية النادرة التي 16S الريباسي جين تسلسل وMALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biology

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

كفاءة نوكليك حمض استخراج و16S الريباسي جين تسلسل للبكتيريا الجماعة توصيف

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

وهناك طريقة لتقييم بكتريوسين الآثار على الأمعاء الدقيقة من الفئران

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

بروتوكول المصحوبة بمرشدين لتوصيف الجراثيم البراز بتسلسل الرنا الريباسي-Amplicon 16S

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Specimen Collection and Analysis of the Duodenal Microbiome

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut microbiome has been typically studied through fecal specimen collections. The ease of obtaining fecal samples has resulted in many studies that have revealed information concerning the distal luminal gastrointestinal tract. However, few studies have addressed the importance of the microbiome in the proximal gut. Given that the duodenum is a major site for digestion and absorption, its microbiome is relevant to nutrition and liver disease and warrants further investigation. Here we detail a novel method for sampling the proximal luminal and mucosal gut microbiome in human subjects undergoing upper endoscopy by obtaining duodenal aspirate and biopsies. Specimen procurement is facile and unaffected by artifacts such as patient preparatory adherence, as might be the case in obtaining colonic samples during colonoscopy. The preliminary results show that the luminal and mucosal microbiomes differ significantly, which is likely related to environmental conditions and barrier functions. Therefore, a combination of duodenal aspirate and biopsies reveal a more comprehensive picture of the microbiome in the duodenum. Biopsies are obtained from the descending and horizontal segments of the duodenum, which are anatomically close to the liver and biliary tree. This is important in studying the role of bile acid biology and the gut-liver axis in liver disease. Biopsies and aspirate can be used for 16S ribosomal RNA sequencing, metabolomics, and other similar applications.

In this manuscript, we discuss a novel method to sample and analyze the duodenal microbiome. This method provides an accurate depiction of microbial diversity and composition in the duodenum and could be useful for further investigation of the duodenal microbiome.

Shifts in the microbiome have been correlated with the physiology and pathophysiology of many organ systems both in humans and in mouse models. The gut ...