Name: moving upwards: a simple and flexible in vitro three-dimensional invasion assay protocol
Uploaded: 2018-03-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol at JoVE.com

وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (نيمهد-G12MD007581) من خلال ركمي-المركز "الصحة البيئية" في جامعة ولاية جاكسون والإدارة الأمريكية للدفاع، فكرة جائزة 11-1-0205.

ملاحظة: يتم وصف هذا البروتوكول في مكاردلي et al. 11-وضع جدول زمني ويرد في الشكل 1.
1-إعداد لوحة الثقافة
<ol><li>أغسل الطبق الثقافة 35 ملم التي تحتوي على 10 ملم زجاج السفلي جيدا مع 1 مل حامض الهيدروكلوريك 1 م (HCl) لمدة 15 دقيقة لخفض hydrophobicity من الزجاج-الأسفل.</li>
	<li>أغسل لوحة الثقافة مرتين مع 1 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS) للتخلص من جميع HCl.</li>
	<li>أغسل لوحة الثقافة مرتين مع 1 مل إيثانول 70%.</li>
	<li>شطف لوحة الثقافة مع 1 مل مستنبت الخلية المحددة (هنا، استخدام α-الفنزويلية وتستكمل مع الحرارة 10% إبطال FBS والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%). ملاحظة: يمكن تخزين لوحة الثقافة المعالجة التي تحتوي على المتوسط الثقافة في الحاضنة2 CO مع مرطب عند 37 درجة مئوية حتى اليوم التالي.</li>
	<li>تنمو الخلايا (MSCs و MCF-7 ثقافة المشاركة) في أسفل الزجاج المعالجة جيدا للطبق الثقافة 35 ملم إلى 100% كونفلوينسي. شارك الثقافة 35,000 MSC الخلايا و 000 75 خلايا MCF7 ح 24.</li>
</ol>2-إعداد جل الكولاجين
<ol><li>تخزين نصائح ميكروبيبيتي تستخدم بيبيتينج جل الكولاجين في الثلاجة لمنع البلمرة الكولاجين عند الاتصال. ملاحظة: وهذه هي الخطوة الأكثر أهمية.</li>
	<li>تحديد وحدة تخزين الكولاجين ذيل الجرذ الأول لاستخدامها استناداً إلى تركيز المخزون الكولاجين. إعداد 100 ميليلتر من جل الكولاجين لهذا التحليل. ملاحظة: تركيزات عالية من الكولاجين ذيل الجرذ أنا الأسهم يعمل بشكل أفضل. تحديد حجم 10 × المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو لاستخدامها لتمييع الكولاجين تبعاً لذلك.</li>
	<li>ضم على الجليد فأر الذيل الكولاجين أنا (3.8 ميكروغرام/مل الأسهم) والمتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو x 10 والمتوسطة الثقافة الخلية x 1 تستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين و chemoattractant مناسبة لتركيز نهائي للكولاجين من 2.4 ملغ/مل.</li>
	<li>إضافة إلى الخليط 4.5% من حل بيكربونات الصوديوم لتحييد جل الكولاجين. ملاحظة: قد تختلف حجم الحل بيكربونات الصوديوم المضافة على درجة الحموضة الدقيق الكواشف الأخرى. فمن الأفضل لاختبار الخليط مع شرائح الأس الهيدروجيني ضمان حل محايدة، أو استخدام مؤشر الرقم الهيدروجيني في الأجلين المتوسط والثقافة.</li>
	<li>تكمن ميليلتر 80 من خليط الكولاجين فوق الخلايا داخل الزجاج-أسفل جيدا للطبق الثقافة.</li>
	<li>السماح الكولاجين هلام بلمرة لمدة 30 دقيقة في حاضنة2 CO مع مرطب عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>تغطي جل الكولاجين مع 2 مل من الخلية المتوسطة مع انخفاض مصل (2 في المائة)، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO مع مرطب 24 أو 48 أو 72 ح. تنبيه: اللوحة يجب أن تعالج الرعاية للحيلولة دون فصل من أسفل الزجاج جل الكولاجين.</li>
</ol>3-مثال لإعداد الكولاجين هلام استخدام مخزون الكولاجين ذيل فأر من 3.8 ميكروغرام/mL
<ol><li>على الجليد، والجمع بين ميليلتر 114.5 الكولاجين ذيل الفئران، 16.6 ميليلتر من 10 × دميم، وميليلتر 33.1 متوسطة الثقافة التي تحتوي على تشيمواتراكتانت.</li>
	<li>تحييد الخليط الكولاجين مع 14.0 ميليلتر من بيكربونات الصوديوم.</li>
	<li>ما زالت كما في الخطوة 2، 5.</li>
</ol>4-التصوير من الخلايا
<ol><li>قم بإزالة الوسائط بلطف من الطبق.</li>
	<li>بلطف شطف الجل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>إصلاح الخلايا مع 1 مل بارافورمالدهيد 4% لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على الحل DAPI (100 نانوغرام/مل) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>صورة الخلايا باستخدام مجهر [كنفوكل] في مواقع مختلفة، وأخذ 400 ميكرون z-رص الصور من كل موقع في 16 ميكرومتر الخطوات. وقد المجهر يستخدم قرص المسح الضوئي وحدة تمكن [كنفوكل] التصوير باستخدام الضوء الأبيض، ومصدر الإثارة القوس. استخدام عدسة X 20 المستخدمة مع الفتحة العددية من 0.75.</li>
	<li>إعادة تشكيل الصور.<ol>
<li>فتح الصور لجل معين (حوالي 25 الصور) وإنشاء رصة صورة عن طريق النقر فوق الصورة ← مكدسات ← الصور المكدس. تقابل الصورة الأولى إلى الجزء السفلي من الهلام (z = 0 ميكرومتر)، الصورة الثانية يناظر الخطوة الأولى في اتجاه z (z = 16 ميكرومتر)، تقابل الصورة الثالثة إلى الخطوة الثانية في اتجاه z (z = 32 ميكرون). تقييم كل نواة في كل عمق الصورة وتعيين العمق الذي كان النواة في أشد التركيز كعمق الغزو لأن خلية معينة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedl, P., Brocker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+cell+locomotion+within+three-dimensional+extracellular+matric.">The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).</li><li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+architecture:+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function.">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li><li>Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing,+a+comparison+of+image-based+readout+methods.">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration:+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis.">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).</li><li>Sahai, E., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differing+modes+of+tumour+cell+invasion+have+distinct+requirements+for+Rho/ROCK+signalling+and+extracellular+proteolysis.">Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis.</a> Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).</li><li>Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+circular+invasion+assay+mimics+in+vivo+invasive+behavior+of+cancer+cell+lines+and+distinguishes+single-cell+motility+in+vitro.">A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro.</a> BMC Cancer. 8, 198 (2008).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).</li><li>Poujade, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound.">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).</li><li>Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+cancer+cell+fusion:+a+mechanism+of+breast+cancer+metastasis.">Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis.</a> FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).</li><li>McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Inverted+Vertical+Invasion+Assay+to+Avoid+Manipulation+of+Rare+or+Sensitive+Cell+Types.">An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types.</a> J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).</li><li>Noubissi, F. K., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Cell+Fusion:+Mechanisms+Slowly+Unravel.">Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li><li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+in+microfluidic+systems.">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).</li><li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+migration+in+three+dimensions.">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li><li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate.">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat Materials. 13, 645-652 (2014).</li></ol>

وقد أعلن الكتاب أنه لا يوجد أي المصالح المتنافسة.

هنا، نحن تصف مقايسة غزو عمودي مقلوب بسيطة وملائمة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا التي نادرة و/أو تعتمد على بهم المكروية. في هذه المقايسة غزو 3D، الخلايا تظل في بهم المكروية الأصلي ومشمولة جل الكولاجين التي تحتوي على تشيمواتراكتانت. الخلايا ثم ترحيل وغزو في الكولاجين. ف?...

خلية حركية عملية إنمائية والفسيولوجية طبيعية من الخلايا. ومع ذلك، تغييرات في النمط وقدرة الخلايا على الهجرة وغزو ترتبط بالحالات المرضية بما في ذلك أمراض التهابات وسرطان خبيث1،،من23. ورم خبيث هو يمكن القول أن الجانب الأكثر غير مفهومة في السرطان. السرطاني، خلايا السرطان يجب أن تتحلل المصفوفة الخلوية إضافية (ECM)، تغزو الأنسجة المحلية وإينترافاساتي. مرة واحدة في الدورة الدموية، والخلايا السرطانية سيتم نشر إلى الموقع البعيد واكسترافاساتي وتشكل الأورام الثانوية. ولذلك، القدرة الخلايا تتحلل إدارة المحتوى في المؤسسة، لترحيل، وغزو مرتبط بامكاناتهم المنتشر. وضعت نهوج مختلفة لتحليل وقياس قدرات الهجرة وغزو الخلايا. وتشمل النهج الأكثر استخداماً الجرح الشفاء المقايسة والوقت الفاصل بين الفحص المجهري والمقايسة الدائرة Boyden. الجرح الشفاء المقايسة4 ووقت مرور الفحص المجهري هي فحوصات بسيطة ومريحة التي سوف تعطي فكرة أولية عن الهجرة الخلية. ومع ذلك، وكلاهما فحوصات 2D لا تعكس البيئة ثلاثية الأبعاد التي توجد فيها الخلايا في الجسم الحي. وقد أظهرت الدراسات أن الخلايا تستجيب بشكل مختلف لبيئة ثلاثية الأبعاد بالمقارنة مع واحد 2D5،6. وعلاوة على ذلك، يصعب فحوصات شفاء الجرح إلى إنتاج وأن تسفر عن نتائج كمية7،،من89. والرزن خلية منطقة الاستبعاد، وتعديل 3D للجرح شفاء المقايسة، تحليل ذات صلة أكثر فسيولوجيا لكن أنها ليست مناسبة للخلايا منخفض في عدد مثل الخلايا المختلطة الناتجة عن خلية الانصهار الأحداث10،11 .
فحص الدائرة Boyden هو فحص ثلاثي الأبعاد الذي يوفر ميكرونفيرونمينتس ذات الصلة للدراسات الخلوية. ومع ذلك، فإنه يتطلب الخلايا المراد إزالتها من على المكروية الأصلي وأن تودع في مجلس الشيوخ نظام مقايسة Boyden لترحيل وغزو نازلا نحو المتوسطة المحتوية على تشيمواتراكتانت. هذا النهج ثلاثي الأبعاد غير المناسبة في تحليل القدرة على الهجرة وغزو الخلايا الضعيفة المكروية و/أو محدودة في عدد10،،من1112. اتباع نهج جديدة لتحليل الهجرة الخلية وغزو هو مقايسة13دائرة التدرج موائع جزيئية. على الرغم من مناسبة وموثوق بها في دراسات الهجرة والغزو، هذا التحليل هو أكثر تكلفة ويمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية لمختبر نموذجي. يصف لنا هنا مقايسة بسيطة غزو عمودي مقلوب هو متوافق مع العديد من أنواع الخلايا بما فيها الخلايا الحساسة لما المكروية و/أو المقيدة في عدد. وكان هذا التحليل مقتبس من البروتوكول المقترح من هوبر وآخرون 14-في هذا التحليل، تبقى الخلايا في بهم المكروية الأصلي وهجرتها ويرصد الغزو كما أنها تتحرك صعودا في جل الكولاجين التي تحتوي على تشيمواتراكتانت11. هذا التحليل استنساخه وقد الأمثل والتحقق من صحتها في الطبق الثقافة 35 ملم. فإنه يمكن تكييفه لظروف المقايسة مختلفة بما في ذلك الثقافة خلية مختلفة الأحجام، ومصفوفات مختلفة أو قوة الالتصاق، وتشيمواتراكتانتس المختلفة. يمكن هذا التحليل بمثابة منصة في المختبر للفحص الأولى في عملية اكتشاف المخدرات.

<table><tbody><tr><td>MatTek P35G-1.5-10C</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>mattek glass bottom dishes</td></tr><tr><td>Rat tail collagen I</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>354236</td><td>Collagen gel</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>H1758</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>10X Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>D2429</td><td>10X DMEM</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Confocal Fluorescent microscope</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>Olympus IX81</td><td>Confocal&amp;nbsp; microscope</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA</td><td>SH30070.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope</td><td>Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA</td><td>40x NA 0.8 objective</td><td>MPLSM</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane Inc. Zurich, CH</td><td>Imaris 7.5.2</td><td>Imaris software</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>50980487</td><td>PFA</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-minimum essential medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC; Manassas, VA, USA</td><td>HBT-22</td><td></td></tr><tr><td>MSC</td><td>Trivedi and Hematti, 2007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X lens UPLAPO</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>36-064</td><td>Olympus UPLSAPO 20X Objective</td></tr></tbody></table>

moving upwards: a simple and flexible in vitro three-dimensional invasion assay protocol

على الرغم من أن قد وضعت فحوصات غزو 3D، يظل التحدي هو دراسة الخلايا دون التأثير على سلامة المكروية بهم. فحوصات 3D التقليدية مثل قاعة Boyden تتطلب أن الخلايا المشردين من موقع الثقافة الأصلية ونقلها إلى بيئة جديدة. هذا تعطيل العمليات الخلوية التي متأصلة المكروية، بل أنه كثيرا ما يؤدي إلى فقدان الخلايا. هذه المشاكل تنطوي على تحديات خاصة عند التعامل مع الخلايا التي أما نادرة، أو حساسة للغاية لتلك المكروية. هنا، نحن تصف وضع مقايسة 3D غزو أن يتجنب كل الشواغل. في هذا الفحص، يتم مطلي الخلايا داخل صغيرة جيدا ووضعت مصفوفة إدارة المحتوى في المؤسسة التي تحتوي على تشيمواتراكتانت من فوق الخلايا. هذا يتطلب لا خلية التشرد، ويسمح للخلايا بغزو صعودا في المصفوفة. في هذا التحليل، يمكن تقييم غزو الخلية، فضلا عن مورفولوجيا الخلايا داخل جل الكولاجين. يمكننا استخدام هذا الفحص، تميز الغازية قدرة خلايا نادرة وحساسة؛ الخلايا المختلطة الناتجة عن اندماج بين خلايا سرطان الثدي MCF7 والوسيطة/multipotent الخلايا الجذعية/ستروما (MSCs).

لقد استخدمنا طبق ثقافة 35 ملم مع زجاج السفلي والفئران الكولاجين ذيل الأول لتطوير وتحسين في المختبر غزو 3D الاعتداء البروتوكول. باستخدام هذا الفحص، واظهرنا ذلك الثدي الخلايا السرطانية MCF7 ولجنة السلامة البحرية يمكن أن تغزو الخلايا في جل الكولاجين إلى متوسط مسافة من 0.04 ...

Watch this Scientific Journal Video about Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol at JoVE.com

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

ويصف هذا البروتوكول مقايسة غزو عمودي مقلوب التي يمكن أن تستخدم لقياس قدرات الهجرة وغزو الخلايا في أجواء ثلاثية الأبعاد مع الحفاظ على المكروية الخلية. هذا التحليل مناسبة لخلايا نادرة و/أو الحساسة.

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

moving-upwards-simple-flexible-vitro-three-dimensional-invasion-assay

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

6.0K Views.  University of Minnesota - Twin Cities. ويصف هذا البروتوكول مقايسة غزو عمودي مقلوب التي يمكن أن تستخدم لقياس قدرات الهجرة وغزو الخلايا في أجواء ثلاثية الأبعاد مع الحفاظ على المكروية الخلية. هذا التحليل مناسبة لخلايا نادرة و/أو الحساسة.

Video: Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medicine

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

و في المختبر غزو الورم FluoroBlok الفحص

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Biology

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

في المختبر فحوصات تقييم الهجرة، والغزو، وانتشار خطوط الخلايا مخلدة تروفوبلست البشرية في الاثلوث الأول

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Developmental Biology

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

والتعديل<em&gt; في المختبر</em&gt; الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

نماذج 3D في بيولوجيا السرطان: ديناميات الغزو في الهيتروسفير

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

تسليط الضوء على المؤلف: فك رموز الحديث المتبادل بين السرطان والخلايا المناعية أثناء تطور سرطان الرأس والرقبة

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

و في المختبر غزو الورم FluoroBlok الفحص

في المختبر فحوصات تقييم الهجرة، والغزو، وانتشار خطوط الخلايا مخلدة تروفوبلست البشرية في الاثلوث الأول

والتعديل

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص