Name: isolation and activation of murine lymphocytes
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Activation of Murine Lymphocytes at JoVE.com

ويدعم هذه الدراسة من قبل وزارة التربية والتعليم، سنغافورة (AcRF Tier1-RG40 / 13 و Tier2-MOE2013-T2-2-038). تم تحرير مخطوطة كتبها ايمي سوليفان من Obrizus الاتصالات.

<ol>
	<li>Nikolich-&#381;ugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+important+facets+of+T-cell+repertoire+diversity.">The many important facets of T-cell repertoire diversity.</a> Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).</li><li>LeBien, T. W., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Brownlie, R., Zamoyska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+signaling+networks:+branched,+diversified+and+bound.">T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).</li><li>Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-rel+regulates+ezh2+expression+in+activated+lymphocytes+and+malignant+lymphoid+cells.">C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells.</a> J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).</li><li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin.">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).</li><li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry.">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li><li>Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na&#239;ve+B+lymphocytes+undergo+homeostatic+proliferation+in+response+to+B+cell+deficit.">Na&#239;ve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit.</a> J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Th17+differentiation+of+na&#239;ve+CD4+lymphocytes.">Isolation and Th17 differentiation of na&#239;ve CD4 lymphocytes.</a> J. Vis. Exp. (79), e50765 (2013).</li><li>Su, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezh2+controls+B+cell+development+through+histone+h3+methylation+and+Igh+rearrangement.">Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement.</a> Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).</li><li>Mecklenbr&#228;uker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C&#948;+controls+self-antigen-induced+B-cell+tolerance.">Protein kinase C&#948; controls self-antigen-induced B-cell tolerance.</a> Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).</li><li>Rush, J. S., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+activated+via+CD40+and+IL-4+undergo+a+division+burst+but+require+continued+stimulation+to+maintain+division,+survival+and+differentiation.">B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation.</a> Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).</li><li>Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes.">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li><li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation:+Terminology+and+practical+considerations.">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود إجراءات لتنقية الخلايا الليمفاوية من الأجهزة اللمفاوية. تنقية الخلايا باستخدام الفرز حبة المغناطيسي هي طريقة سريعة وبسيطة يمكن أن ينتج قابلة للحياة، الخلايا المستهدفة عالي النقاء. خطوات حاسمة في إطار بروتوكول بقاء الخلية والعائد الخلية الحفاظ على سلامة خلايا النسب المكونة للدم في المختبر أمر بالغ الأهمية لضمان التجارب الناجحة وقابلة للتكرار. الكيميائية والبيولوجية والكواشف، الظروف التجريبية دون المستوى الأمثل أو ظروف التخزين غير لائق من أجهزة رفعه يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية. على الختان من الفئران، تحتاج إلى تخزينها على الجليد وتعليق خلية واحدة مستعدة في أقرب وقت ممكن الأجهزة اللمفاوية. وينبغي أيضا تجنب السرعة الفائقة الطرد المركزي من الايقاف الخلية. وعلاوة على ذلك، ينبغي خففت الكريات الخلية عبها أنابيب مع الأصابع بعد إزالة طاف. ليسوأوصت لاعادة تعليق الكريات مباشرة مع كميات كبيرة من المتوسطة من قبل pipetting. ما يقرب من 2-4 × 10 7 خلايا الطحال B و 2 × 10 7 خلايا تي من جميع الغدد الليمفاوية الرئيسية يمكن أن تكون معزولة عن بعضها الماوس WT القديم أسابيع 8-10. تناقص أعداد تنقية البائية والخلايا التائية (أقل من القيمة المتوقعة) إلى ظروف دون المستوى الأمثل، كما ذكر في وقت سابق. نقاء خلية متوسط نقاء خلايا معزولة باستخدام هذا البروتوكول هو في نطاق بين 90 و 95٪، والذي هو محض بما فيه الكفاية لاحقا في المختبر أو في التجارب المجراة (الشكل 1A). ومن المستحسن ألا تفرط في عمود الفصل مع أرقام زائدة من الخلايا خلال عملية الانفصال لأن ذلك يمكن أن تمس نقاء الخلية نظرا لقدرة ملزمة محدودة العمود. جودة FBS الجودة FBS المستخدمة لاستكمال مستنبت أمر بالغ الأهمية من أجل بقاء في المختبر من الخلايا الليمفاوية. FBS من مصادر ودفعات مختلفة قد تختلف في قدرتها على دعم في استجابات الخلايا اللمفاوية في المختبر. وبالتالي، فمن المهم لاختبار أنواع مختلفة من FBS العثور على واحد أن يعطي استجابة عالية محددة مع الخلفية منخفضة. وينبغي بعد ذلك احتفظ عدد كبير من زجاجات باعتباره الأسهم. التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها شروط وضع العلامات CFSE على الرغم من CFSE وضع العلامات يعمل في سهل RPMI، وجدنا أن استخدام نسبة منخفضة من FBS في برنامج تلفزيوني يقلل موت الخلايا أثناء عملية التحميل، دون المساس كفاءة وضع العلامات. وعلاوة على ذلك، فإن وجود FBS يقلل من فقدان الخلية أثناء الطرد المركزي. جانب هام من جوانب CFSE الوسم هو ضمان حتى وسم الخلايا من أجل رؤية ذروة متميزةالصورة التي تمثل انقسام الخلايا. الحمولة الزائدة من CFSE يمكن أن يؤدي إلى زيادة موت الخلايا في المختبر أو ضعف الانتعاش من الخلايا المسمى في الجسم الحي. من ناحية أخرى، وعدم كفاية CFSE وضع العلامات أو عدم التجانس في تعليق خلية الهدف أثناء عملية وضع العلامات يمكن أن يؤدي إلى سوء حلها CFSE قمم 12. وبالتالي، فمن المهم تحسين الظروف CFSE وضع العلامات. يجب أن تبقى كمية CFSE تستخدم لوضع العلامات عند أدنى مستوى ممكن للحد من الآثار السامة المحتملة من الحمولة الزائدة، ولكن لا يزال يحقق العلامات كافية للكشف عن القمم حل لطيف على التحفيز ضمن الإطار الزمني التجريبي. وبالإضافة إلى ذلك، لتجنب قمم سيئة حلها، يجب إزالة كتل الخلايا من تعليق خلية واحدة قبل CFSE التحميل. كتل الخلايا وفقدان الخلية ومن الأهمية بمكان التأكد من أن الخلايا تماما إعادة علقت قبل الانتقال إلى الخطوة التالية لأن remova دائملتر من كتل الخلايا خلال التجربة يخفض بشكل كبير أعداد الخلايا. عادة ما ترتبط كتل الخلايا مع انخفاض بقاء الخلية أو عدم كفاية اعادة تعليق بيليه الخلية. CFSE والأطياف الانبعاثات التداخل خلايا CFSE المسمى يمكن زيادة المعرفة مع الأجسام المضادة fluorophore مترافق بعد يوم واحد في الثقافة، ولكن هذه الخلايا المسمى CFSE لا تزال فلوري الزاهية بعد يوم في الثقافة. باستخدام مزيج من الأجسام المضادة مترافق fluorophores مشرقة مع كميات ضئيلة من التداخل أطياف الانبعاث مع CFSE، مثل فيكوإيريترين (PE) وفيكوإيريترين-cyanine 7 (PeCy7)، يقدم نتائج تلطيخ الأمثل. ومع ذلك، والتعويض للحد ما زالت هناك حاجة أطياف الانبعاث التداخل. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لكثافة عالية من CFSE إشارة (FL-1 قناة) الذي يصب في قناة FL-2، قناة FL-2 يجب أن يكون التعويض عن طريق خصم نسبة عالية من قيمة FL-2 لتحقيق التقيدالملف الشخصي آي مال CFSE. يمكن للمرء أن يشير إلى ورقة نشرتها كواه وآخرون، والتي توفر حلولا لوصفها استكشاف الأخطاء وإصلاحها CFSE وتحليل نتائج 12. بدائل لCFSE طيف انبعاث CFSE يقيد استخدام مزيج من CFSE مع المشتقات فلوريسئين مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وثيوسيانات فلوريسئين (FITC) الأجسام المضادة -conjugated. هناك، ومع ذلك، وغيرها من الأصباغ خلية المتاحة تجاريا مع كثافة عالية بالتساوي مضان وسمية منخفضة خلية في اللون البنفسجي (CTV، الإثارة / الانبعاثات: 405/450 نانومتر) والأصفر (كتي، 555/580 نانومتر)، أحمر بعيد (CTFR، 630 / 661 نانومتر أو CPD670، 647/670 نانومتر) والأحمر (PKH26، 551/567 نانومتر). باستخدام الأصباغ خلية وضع العلامات مع أطياف الانبعاث مختلفة توفر المرونة في التصميم التجريبي. من ناحية أخرى، ليس كل من الأصباغ خلية وضع العلامات المذكورة أعلاه يمكن أن تولد متميزة قمم انقسام الخلايا. أجريت دراسة مقارنة باستخداموخلصت الأصباغ المختلفة خلية البطاقات التي CTV هو استبدال أفضل لCFSE لCTV يمكن من اكتشاف عدد من ذروات انقسام الخلايا واضحة المعالم (13). القيود الحد الرئيسي لفرز الخلايا المغناطيسي هو أنه لا يصلح إلا للفرز الخلايا بسيط. في هذا المثال، يمكن أن نستخدم CD43 في استنزاف جميع الخلايا غير B-من الطحال. ومع ذلك، ونحن لن تكون قادرة على فصل الخلايا البائية مسامي من منطقة هامشية الخلايا البائية. ويمكن تعريف هؤلاء السكان الفرعي فقط مع علامات سطح متعددة. في حين أنه من الممكن لتحديد إيجابيا الخلايا باستخدام الخلايا المغناطيسية الفرز على أساس علامات سطح متعددة، أنها تعتمد على الكواشف معدة خصيصا، المتاحة تجاريا التي تمكن من الافراج عن ميكروبيدات من الخلايا المستهدفة بعد الجولة الأولى من الفرز قبل الانتقال إلى علامة ثانية. وبالتالي، فإن المستخدم سيكون تعتمد اعتمادا كليا على مجموعات المتاحة تجاريا. في مثل هذه الحالة، FACS طهو أكثر فائدة بكثير في فصل السكان خلية المكرر. أهمية تقنية خلية فرز النهج القائم على الأجسام المضادة، مثل فرز الخلايا المغناطيسي ونظام مراقبة الأصول الميدانية، هي الخلايا الأكثر موثوقية فرز التقنيات حتى الآن 15. وسائل أخرى للفصل الخلية موجودة، بما في ذلك التقنيات المعتمدة الكثافة وعلى أساس الالتزام، ومع ذلك، الخلايا الليمفاوية هي الخلايا سيئة ملتصقة والقطعان متشابهة نسبيا في الكثافة، وبالتالي adherence- وتقنيات إما أن تكون غير قابلة للتطبيق على أساس الكثافة أو غير فعالة جدا 15 . كما ذكر في المقدمة، سريعة وبسيطة، وارتفاع بقاء الخلية، ومستقلة عن أي معدات متطورة هي ملامح الفائز من الخلايا المغناطيسية فرز أكثر من نظام مراقبة الأصول الميدانية. ولا سيما، نضوب السلبي باستخدام الخلايا المغناطيسية فرز العلامات ويستنزف الخلايا غير المرغوب فيها باستخدام عمود الفصل المغناطيسي، وعزل الخلايا المستهدفة مع الحد الأدنى من modificatioنانو ثانية إلى سطح الخلية والحفاظ على الدولة ساذجة. التطبيقات المستقبلية الخلايا اللمفية عالي التخصيب، قابلة للحياة، وساذجة تنقيته باستخدام هذه التقنية تنقية مقرها المغناطيسي يمكن أن تخضع لفحوصات وظيفية مختلفة من السلوك لمفاوية ويشير الآليات في التجارب المختبرية والحية. في هذا البروتوكول، وأثبتنا باستخدام اثنين من مختلف المقايسات تكاثر الخلايا - [3 H] -thymidine فحص التأسيس وCFSE تكاثر الخلايا الفحص - للتحقيق قدرات خلية التكاثري من الخلايا اللمفية تفعيلها. الاختيار بين [3 H] -thymidine فحص التأسيس وCFSE تكاثر الخلايا فحص يعتمد إلى حد كبير على حجم العينة والظروف التجريبية. الاستفادة من [3 H] فحص التأسيس -thymidine في تجارب مع أحجام عينة كبيرة يولد البيانات تكاثر الخلايا الإنتاجية العالية. من أجل ضمان الأمثل [&lt;سوب&gt; 3 H] امتصاص -thymidine واستنساخ نتائج، [3 H] -thymidine يجب أن تضاف إلى ثقافة عندما تكون الأغلبية من الخلايا هي تقسيم بنشاط. مطلوب الأمثل لوضع العلامات بروتوكول لأنواع مختلفة من الخلايا والمحفزات. وعلاوة على ذلك، نظرا لطبيعة المشعة من [3 H] -thymidine، لا يمكن إلا أن يتم تنفيذ هذا الاختبار في المختبر التأسيس، على عكس وضع العلامات CFSE من الخلايا، والتي يمكن تفعيلها في المختبر (الشكل 2B) أو adoptively نقلها إلى الفئران المتلقي (الشكل 1B و1C). وCFSE تكاثر الخلايا الفحص، من ناحية أخرى، ويقدم المزيد من المعلومات عن انتشار الخلايا من [3 H] التأسيس -thymidine. منذ كثافة CFSE في الخلايا المسمى CFSE يقلل بمقدار النصف مع كل انقسام الخلايا، يمكن للمرء تحديد عدد من الانقسامات الخلوية ونسبة الخلايا في كل قسم عن طريق حساب عدد وحجم القمم <suص&gt; 12،13. وعلاوة على ذلك، الخلايا المسمى CFSE ويمكن كذلك تعريف إلى مجموعات فرعية مختلفة وفقا لتعبير جزيء سطحها عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة fluorophore مترافق المقابلة. الأهم من ذلك، على عكس [3 H] فحص التأسيس -thymidine الذي يقيس تكاثر الخلايا في نقطة زمنية نهائية، وCFSE تكاثر الخلايا فحص يسمح لتتبع انقسام الخلايا، وتوفير مزيد من المعلومات حول حركية قدرة تكاثر الخلايا. ومع ذلك، فإن CFSE تكاثر الخلايا الفحص قد لا تكون مناسبة لإجراء التجارب على عينات كبيرة الحجم.

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the na&#239;ve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells. 
Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors. 
Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify na&#239;ve B cells or T cells.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (without L-Glutamine)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td></td><td>Heat inactivated&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD43 magnetic microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>Mix well prior use</td></tr><tr><td>Streptavidin microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>Mix well prior use</td></tr><tr><td>Anti-Annexin V magnetic beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>Mix well prior use</td></tr><tr><td>MACS LD&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom sterile culture plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>96-well F-bottom sterile culture plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer mesh</td><td></td><td></td><td>To sterilize using UV radiation prior use</td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m&amp;nbsp; sterile disposable filter units</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>Can be substituted with any sterile filter device</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV for short; alternative to CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY for short; alternative to CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR for short; alternative to CFSE</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Dye eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670 for short; alternative to CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, alternative to CFSE</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>Can use from other sources</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)</td><td>Molecular Probes</td><td>C-1157</td><td>Reconstitute in DMSO</td></tr><tr><td>Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (Calcium ionophore)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies and recombinant protein&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b biotin (clone m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>CD11c biotin (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>Ter119 biotin (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>TCR-&amp;gamma;&amp;delta; biotin (clone GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>CD19 biotin (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>B220 biotin (clone RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>CD49b biotin (clone DX5)</td><td>Biolegend</td><td>108904</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>CD4 biotin (clone GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100404</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>CD8 biotin (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>T cell depletion cocktail</td></tr><tr><td>F(ab&amp;rsquo;)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 &amp;micro;l/well for coating (96-well)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)</td><td>Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>553722</td><td>50 &amp;micro;l/well for coating (96-well)</td></tr><tr><td>Recombinant IL-4</td><td>ProSpec&amp;nbsp;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS from E. coli Serotype 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)</td><td>eBioscience&amp;nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 &amp;micro;l/well for coating (96-well)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated)</td><td>eBioscience&amp;nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 &amp;micro;l/well for coating (96-well)</td></tr><tr><td>Recombinant IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from chicken egg white, Ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and activation of murine lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

تنقية الخلايا المغناطيسية من الخلايا الليمفاوية يسمح للمستخدمين لتنقية السكان الخلية المستهدفة في فترة قصيرة نسبيا من الزمن. باستخدام بروتوكول استنزاف لدينا، كنا قادرين على زيادة النسبة المئوية للخلايا التائية CD8 (OT-I في وتفعيل إعادة التركيب الجيني 1 (الفريق الاستشاري-1) الفئران -deficient) من 72.8٪ (قبل تنقية) إلى 94.2٪ (بعد تنقيتها. الشكل 1A) 4،5. ويمكن بعد هذه الخلايا الليمفاوية تنقيته أن تستخدم لفحوصات وظيفية المصب لتحديد انتشار الخلايا اللمفاوية ونقل الإشارة 4،5. على سبيل المثال، يمكن أن ندرس في الجسم الحي T قدرة تحفيز الخلايا من ناقلات الجنود المدرعة عن طريق نقل المسمى CFSE، خلايا تي مستضد معين في wildtype (WT) ومتحولة (MT) الفئران تحصين مع مستضد مناسبة 5. في تجربة تمثيلية لدينا، ونقل النقي، وصفت CFSE، ألبومين البيض (OVA) محددة OT-I CD8 T جملتعلمي اللغة اإلنكليزية إلى سيطرة (WT) ومتحولة الفئران (MT)، وتحصين هذه الفئران بعد يوم واحد من البروتين OVA. بعد ثلاثة أيام التحصين، ونحن تحصد الغدد الليمفاوية (القريبة والبعيدة) والطحال وتحليل خلايا T التدفق الخلوي. ويمكن استخدام CD45 أشكال أليلية لأفضل فصل الفاصل، CFSE المسمى والجهات المانحة خلايا OT-I CD8 من المتلقي الخلايا غير المسمى، CD8 T. في هذا المثال، المانحة والمتلقية الخلايا من CD45.1 وCD45.2 الفئران، على التوالي (الشكل 1B). وتستخدم مستويات CFSE من الباقين على قيد الحياة، وخلايا OT-I T unstimulated عند هذه النقطة الوقت لتحديد الذروة للخلايا غير المتكاثرة (الشكل 1C، الخط المنقط). على التحفيز، وشدة مستويات CFSE في الخلايا OT-I T يقلل بمقدار النصف مع كل شعبة. تي تكاثر الخلايا وبذلك يمكن تحديد عن طريق حساب عدد من CFSE قمم 6،12. في نتائج تمثيلية لدينا، ونحن لا نرى الاختلافات في القدرات عبر تقديم WT وMT ناقلات الجنود المدرعة (الشكل 1C، خطوط الصلبة)، منذ خلايا T تتكاثر بمعدلات مماثلة في كل من الفئران. في تجربة منفصلة، أجرينا [3 H] التأسيس -thymidine فحص لدراسة تكاثر الخلايا من السيطرة تنشيط الخلايا وMT تي. وقد حفز خلايا تنقيته WT وMT T مع مختلف المحفزات لمدة 48 ساعة ونابض مع [3 H] -thymidine ل8 ساعة الأخيرة. وتكاثر الخلايا في S-مرحلة من مراحل دورة الخلية دمج النوكليوتيدات رديولبلد، [3 H] -thymidine، إلى حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين تصنيعه حديثا (DNA)، لذلك، وذلك باستخدام عد التلألؤ السائل، ويمكن قياس تكاثر الخلايا بواسطة [3 H] امتصاص -thymidine. عدد من التهم في الدقيقة (CPM) يرتبط بشكل مباشر مع كمية من [3 H] امتصاص -thymidine في تكاثر الخلايا T. في نتائج تمثيلية، وانخفاض عدد التدوير تم الحصول عليها من خلايا MT T على التحفيز مقارنة جounts من خلايا WT T تشير إلى قدرة التكاثري للخطر من خلايا MT T (1D الشكل). لتحديد الخلايا البائية قدرة التكاثري، ونحن تنقية الخلايا البائية الطحال باستخدام استراتيجية استنزاف وصفها. على تنقية، كنا قادرين على زيادة النسبة المئوية للخلايا B220 B (WT الفئران) من 63.9٪ (قبل تنقية) إلى 98.4٪ (بعد تنقيتها، الشكل 2A) 4. مماثلة لتنقية خلايا تي، الخلايا البائية الطحال النقاء يمكن أن تستخدم أيضا لالمقايسات الفنية المصب لتقييم انتشار الخلايا اللمفاوية ونقل الإشارة 4. وفي وقت لاحق، ونحن المسمى خلايا الطحال WT النقاء B مع CFSE وتحفيز هذه الخلايا في المختبر باستخدام لوحات مغلفة مع مكافحة CD40 تستكمل مع خلوى IL-4. بعد ثلاثة أيام من التحفيز، وقمنا بتحليل قابلة للحياة، وخلايا B تفعيلها من خلال التدفق الخلوي. مستويات CFSE من الباقين على قيد الحياة، وتستخدم الخلايا البائية unstimulated في هذه المرحلة من الوقت لتحديد الذروة للخلايا غير المتكاثرة (الشكل 2B، الخط المنقط). مماثلة لخلايا T، فإن شدة مستويات CFSE في خلايا B يقلل بمقدار النصف مع كل شعبة 6،12. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54596/54596fig1.jpg" /> الشكل 1: الشخصية CFSE من adoptively خلايا OT-I T تنقيته نقل بعد التحصين (A) CD4 و CD8 تلطيخ الخلايا المعزولة من OT-I؛ الفريق الاستشاري-1-نقص الفئران قبل (اللوحة العليا) وبعد (اللوحة السفلى) استنزاف الخلايا غير T. (B) المؤامرات FACS التمثيلية للخلايا T من الطحال (SP)، والعقد الليمفاوية القريبة (PLN)، والعقد الليمفاوية البعيدة (DLN). الجهات المانحة خلايا OT-I CD8 T وCD45.1 إيجابي. ملامح (C) الممثل CFSE من، وصفت CFSE-OT-I المانحة خلايا T نقلها من الطحال (SP)، والعقد الليمفاوية القريبة (PLN)، والعقد الليمفاوية البعيدة (DLN) من WT (مظللة منحنيات) وMT (خطوط الصلبة) الفئران المتلقي 3 أيام بعد التطعيم مع البروتين OVA وLPS. خط منقط يشير خلايا OT-I T من الفئران المتلقي WT دون التحصين (حقن PBS). (د) تكاثر الخلايا من السيطرة المنشط أو خلايا تي MT مقاسا [3 H] فحص امتصاص -thymidine. يتم عرض النتائج في التهم لكل دقيقة (CPM). السيطرة النقاء (بار مفتوح) أو MT (شريط مغلقة) وحضنت الخلايا T لمدة 48 ساعة في المتوسط ​​فقط (المتوسطة) أو في وجود محدد لوحة لمكافحة CD3 أو مكافحة CD3 زائد مكافحة CD28 مع أو بدون ايل المؤتلف 2. واندلعت تنشيط الخلايا بولكلونل من قبل سلطة النقد الفلسطينية (phorbol استر) وA23 (حامل الأيون الكالسيوم). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54596/54596fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54596/54596fig2.jpg" /> الشكل 2: الشخصية CFSE منالخلايا البائية عليها في المختبر التحفيز. (A) B220 وCD3 تلطيخ الخلايا الطحال معزولة عن WT الفئران قبل (اللوحة العليا) وبعد (اللوحة السفلى) استنزاف الخلايا غير B. (ب) لمحة الممثل CFSE من WT المسمى CFSE (منحنى مظللة) خلايا B الطحال بعد 3 أيام في المختبر التحفيز مع لوحات مغلفة مع مكافحة CD40 وIL4. خط منقط يشير المسمى CFSE خلايا WT B دون التحفيز. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54596/54596fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Activation of Murine Lymphocytes at JoVE.com

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

isolation-and-activation-of-murine-lymphocytes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.0K Views.  Nanyang Technological University. Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Video: Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

بروتوكول عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الماوس ومن تفعيل اللاحقة في المختبر مع مجمعات محصنة ضد الورم

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Cancer Research

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biology

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

عزل الخلايا البطانية من الشعيرات الدموية اللمفاوية الجلدية للفئران

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

تسليط الضوء على المؤلف: العزل المغناطيسي القائم على حبة من الخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية الفئران

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

عزل الخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية للفأرين

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...