Name: sample preparation for mass cytometry analysis
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis at JoVE.com

Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).

<ol>
	<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398 (2012).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization.">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li><li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization.">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li><li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry.">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li><li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling.">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li><li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry.">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry.">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).</li><li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry.">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li><li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival/proliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem/progenitor+cells.">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development.">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining.">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li><li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data.">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li><li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data.">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li><li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry.">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li><li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizaing+Data+using+t-SNE.">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li><li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry:+Measure+for+measure.">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li><li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+cytometry.">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li><li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brilliant+violet+fluorophores:+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments.">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li><li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-FISH:+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry.">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li><li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بروتوكول المقدمة هنا قد استخدمت بنجاح لمعالجة مختلف خطوط مثقف الخلايا (H1 و H9 hESCs، mESCs، MCF7، HEK 293، KBM5، HMEC، MCF10a) وعينات الأنسجة الابتدائية (الماوس نخاع العظام، والماوس الكبد الجنينية، والكبار الماوس الكبد والورم الماوس). بغض النظر عن المصدر، أي نوع من الأنسجة التي يمكن فصلها إلى الخلايا وحيدة مع الحفاظ على الدولة الخلوية وينبغي أن تكون قابلة للتحليل من قبل كتلة الخلوي، ولكن قد يتطلب بعض التحسين البروتوكول. ومن المهم أن نلاحظ أن بعض الحواتم قد تتأثر علاجات محددة التفكك، وتثبيت permeabilization المستخدمة، وربما تحتاج هذه الأساليب للخضوع لتحسين عينة محددة. إذا لوحظ إشارة منخفضة للجسم قد يكون من الممكن لتحسين أداء الخلايا التي وصفها على سطح الخلايا الحية، وأساليب permeabilization تغيير أو تقليل وقت التثبيت. عندما يكون ذلك ممكنا في التصميم التجريبي، بما في ذلك المتوازية في اله تجهيز العينات سير العمل يضمن الاتساق بين العينات على مستوى تركيز الخلايا والأجسام المضادة. دون المتوازية، حتى عندما يؤخذ عناية كبيرة للسيطرة على تجهيز العينات، فمن المرجح أن تكون هناك اختلافات طفيفة في تركيز الأجسام المضادة وتركيز خلية سيتم عرضه بين العينات. وعلاوة على ذلك، والنسب المئوية للخلايا إيجابية لالحواتم محددة ستختلف على الأرجح بين العينات، وفعالة نسبة الأجسام المضادة إلى حاتمة قد تختلف بالضرورة بين العينات حتى لو يتم الحفاظ على تركيز الأجسام المضادة الكلي ثابت، مما قد يؤدي إلى تناقضات في تلوين الأجسام المضادة. هذه الاختلافات، في حين قاصر عموما عند مراقبة قناة واحدة، يمكن أن تصبح تتفاقم بشكل كبير عند تنفيذ تجربة عالية معلمة ويمكن أن يساء تفسيرها على أنها ذات مغزى من الناحية البيولوجية إذا لم يتم توخي الحذر خلال تحليل البيانات. تحليل ينتج عن ذلك من البيانات من كتلة الخلوي التجربة يمكن أن تتخذ أشكالا عديدة، وعدد من computaوقد تم تكييف المناهج tional خصيصا لهذا التطبيق. في الوقت الذي توفر مسح شامل لخوارزميات مفيدة للكتلة الخلوي تحليل البيانات خارج نطاق هذه المخطوطة، ويسلط الضوء على الأساليب التي استخدمت بنجاح ويتم توجيه القراء المهتمين إلى موارد متعددة تغطي هذا الموضوع 21 و 22 و 23. اثنين من النهج المتاحة حاليا الأكثر استعمالا لتحليل البيانات كتلة الخلوي وشجرة الامتداد التقدم الكثافة تطبيع الأحداث (SPADE) وviSNE. SPADE تشكل مجموعات من مجموعات من الخلايا مع التعبير علامة مماثلة، وتمثل كل مجموعة كعقدة. يتم ترتيب هذه العقد إلى شجرة SPADE حيث ترتبط العقد مماثلة من قبل خط (الشكل 3G). viSNE يستخدم توزيع t الاستوكاستك الجار تضمين خوارزمية 24 لتوليد تمثيل ثنائي الأبعاد للالبيانات البعد عالية مع الحفاظ على بنية البيانات بشكل عام. مكتوبة على حد سواء SPADE وviSNE في MATLAB، هو رمز مصدر متاح بحرية، ويمكن أن تدار من قبل المستخدمين مع MATLAB. بالإضافة إلى ذلك، إصدار مستقل من SPADE هو متاح. في حين الخلوي الشامل يسمح حاليا جمع أكبر عدد من المعلمات، قد يكون الخلوي على أساس العلامة الفلورسنت أفضل نهج لبعض التطبيقات. مضان التدفق الخلوي يمكن تحليل المزيد من الخلايا في الثانية الواحدة، وتصل إلى 5 × 10 4 مقارنة 500-1،000 لكتلة الخلوي، وأكثر المتاحة الأجسام المضادة 25 التحقق من صحة. التطورات إضافية في التدفق الخلوي مضان، مثل الطيفي الخلوي 26 و fluorophores الجديدة 27 تدفق مضان جعل الخلوي بديلا مجديا للجميع ولكن التجارب المعلمة عالية جدا. تقنيات إضافية مثل قياس RNA 28 سابقا ممكن فقطمن التدفق على مضان الخلوي تم تكييفها مؤخرا إلى كتلة الخلوي السماح كشف في وقت واحد من البروتين والحمض النووي الريبي (29). التوسع المستقبلي للنظائر والكواشف المتاحة للاستفادة أكثر تماما نافذة الشامل النظائر القابلة للقياس وتوسيع ذخيرة من الخصائص الخلوية قابلة للقياس وتوسيع عمق التنميط ممكن من الكتلة الخلوي. عدد كبير من المعلمات التي يمكن تحليلها في وقت واحد عن طريق الخلوي كتلة يوسع كثيرا من الأسئلة التجريبية التي يمكن التحقيق فيها. نأمل أن تكون هذه المادة والمرافق بروتوكول الفيديو سيمكن الباحثين المهتمين للاستفادة أكثر فعالية كتلة الخلوي للمضي قدما أبحاثهم.

الخلوي تمكن من قياس وقت واحد من الأهداف الأجسام المضادة متعددة على مستوى خلية واحدة عبر أعداد كبيرة من الخلايا. في التقليدية التدفق الخلوي القائم على مضان، وعدد من المعلمات التي يمكن قياسها كميا محدودة بسبب التداخل الطيفي بين طيف الانبعاث من fluorophores متعددة، الأمر الذي يتطلب حسابات التعويضات التي تزداد تعقيدا كما يزيد عدد المعلمات. وتعالج هذه القيود من قبل كتلة الخلوي، حيث تم الكشف عن الأجسام المضادة المعادن مترافق الثقيلة وكميا من قبل وقت الرحلة (TOF) مطياف الكتلة لتوسيع كبيرة في عدد من المعلمات التي تم جمعها في وقت واحد وتسفر عن الأبعاد الشخصية نسبة عالية من البروتين وفرة لكل خلية على حدة. فهم أساسي للعمل من كتلة الخلوي الصك هو مفيد للمستخدم، وربما تكون ضرورية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. للحصول على وصف أكثر دقة من ضبط وتشغيل الجهاز الخلوي الجماعي،انظر المخطوطة ذات الصلة 1. لفترة وجيزة، وصفت عينة الخلية مع لجنة من الأجسام المضادة مترافق المعدنية تستهدف علامات سطح الخلية والبروتينات حشوية، والبروتينات النووية والبروتينات محددة لونين أو غيرها الحواتم الفائدة (الشكل 1I). يتم تحميل الخلايا المسمى على الجهاز، إما في وقت واحد عن طريق الحقن اليدوي أو استخدام الاوتوماتيكى أن عينات من لوحة 96-جيدا. يتم حقن الخلايا تحميلها من خلال البخاخات، والذي يولد رذاذ من قطرات سائلة التغليف الخلايا (الشكل 1ii). يتم وضع هذا الرش بحيث يتم المتأينة الخلايا عن طريق الشعلة الأرجون البلازما. هذا التأين يولد سحابة الجسيمات التي تتألف من جميع الذرات المكونة من كل خلية (الشكل 1iii). كما تنتقل هذه السحابة الجسيمات إلى كاشف، يتم فصل ذرات منخفضة الكتلة الذرية من الأيونات الشامل عالية من قبل مرشح الشامل رباعي. استمرت المتبقية أيونات جماعية عالية لكاشف، حيث abund<html> وكميا تعصب كل النظائر (الشكل 1iv). البيانات الخام التي تم جمعها من قبل كاشف، وتحليلها من قبل كتلة البرنامج الخلوي أداة لتحديد الأحداث الخلية. لكل حدث الخلية التي تم تحديدها، وكميا إشارة الكشف في كل قناة وحفظها إلى ملف ناتج .fcs. القنوات كتلة تستخدم للكشف عن الأجسام المضادة المعادن الثقيلة مترافق يحمل الحد الأدنى من التداخل الطيفي، والتي تتراوح 0-4٪ مع معظم المساهمات أقل من 1٪. وبسبب هذا المنخفض عبر الحديث بين القنوات، وليس من الضروري عموما لتحويل البيانات مع مصفوفة التعويض أمام تحليل 2. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر أثناء تصميم لوحة التجريبية من الأجسام المضادة للتأكد من أن الأجسام المضادة مع حاتمة عالية وفرة-لم يتم تعيين إلى قناة الجماهيرية التي تساهم إشارة إلى قناة المسندة إلى الأجسام المضادة وفرة منخفضة، لأن هذا قد خلق السكاني المرتفع بشكل مصطنع في القناة تلقي مساهمة إشارة. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; إعداد الدقيق للعينات لكتلة تحليل الخلوي تعتمد اعتمادا كبيرا على أنواع العينات التي يتم جمعها والفرضية التجريبية التي يجري اختبارها. نحن نقدم أمثلة على بروتوكولين لحصاد أنواع مختلفة من الخلايا (خلايا جذعية جنينية بشرية) والخلايا الأولية (الماوس ورم الثدي الخلايا الظهارية عزل). عند بداية دراسة الخلوي الجماعي، فإنه من المستحسن أن أولا بتنفيذ تجربة رائدة صغيرة للتأكد من أن جميع البروتوكولات والأجسام المضادة ليتم الاستفادة منها تعمل بشكل جيد في يد المحقق. وهذا أمر ضروري وخصوصا عندما تكون لاستخدامها الأجسام المضادة مترافق العرف، كرد فعل تخفيض جزئي خلال تصريف الأجسام المضادة لديه القدرة على تعطيل الجسم المضاد تقارب. لذلك، يحتاج كل الأجسام المضادة مخصصة ليتم التحقق من صحتها تجريبيا لضمان دقة البيانات. وتشمل الاعتبارات الأخرى تحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة سطح الخلية لاستخدامها في فحص ستعترف الحواتم الخاصة بهم بعد تثبيت أو إذا كانت NEإد ليتم تطبيقها على العيش الخلايا. بعض التثبيت قد منع تلطيخ السليم مع الأجسام المضادة سطح الخلية كما هو معروف أن تحدث مع الببتيد MHC تلطيخ 3 و 4. أداء سطح الخلية تلوين الأجسام المضادة على الخلايا الحية قد يكون من الضروري بالنسبة لبعض الأجسام المضادة، ولكن هذا يحول دون خيار المتوازية قبل وضع العلامات الأجسام المضادة كما يتم تنفيذ معظم الطرق المتوازية بعد تثبيت 5 على الرغم من أن القائم على الأجسام المضادة المتوازية 6 و 7 استثناء. عند تحديد عدد الخلايا لتكون على استعداد لتحليل، فمن المهم أن نعرف أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الخلايا تحميلها على الجهاز سوف يتم الكشف عن وإنتاج البيانات. ومن المقرر في المقام الأول إلى عدم فعالية هذه الخسارة عندما يرش على البخاخات العينة في الشعلة. فقدان في المئة الدقيقة تعتمد على كتلة الخلوي إعداد الجهاز ونوع من الخلايا ولكن يمكن أن تتراوح 50-85٪ ويجب أن تكونفي الاعتبار عند تصميم التجربة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لالخلايا 2x10 6 لكل عينة ولكن يمكن تكييفها لمعالجة أحجام أصغر أو أكبر عينة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع الحد الأدنى من التعديلات لأحجام عينة من 1 × 06-04 أكتوبر × 10 6، ومع ذلك فمن الأهمية بمكان أن تظل حجم العينة بما يتفق ضمن التجربة. التغيرات في عدد الخلايا يمكن أن تؤثر على شدة المتوازية وتلوين الأجسام المضادة ويجب أن تبقى متسقة تقريبا عبر عينات لمقارنة مباشرة. ، ينبغي إجراء بعض الإجراءات، مثل وضع العلامات خلية ميتة ووضع العلامات DNA في الغالبية العظمى، إن لم يكن جميع التصاميم التجريبية. وضع العلامات على الخلايا الميتة في التجارب تحليل فقط علامات سطح يمكن تحقيقه باستخدام Rh103، ولكن Rh103 ينبغي تجنبها للتجارب التي تتطلب permeabilization كما أنه يؤدي إلى فقدان تلطيخ. لالتجارب التي تنطوي permeabilization، فإنه من المستحسن للاستفادة سيسبلاتين <sحتى الطبقة = &quot;XREF&quot;&gt; 8، وعندما يكون ذلك ممكنا، والأجسام المضادة الاعتراف PARP المشقوق أو المشقوق كاسباس للكشف عن خلايا أفكارك والميتة. يمكن عينات المتوازية خفض استهلاك الأجسام المضادة، وانخفاض اكتساب الوقت والقضاء على عينة إلى عينة تقلب 9. عملية المتوازية ينطوي على تطبيق نموذج التعليمات البرمجية الخاصة فريدة من نوعها لجميع الخلايا، والذي يستخدم لتعيين كل خلية لنموذج المنشأ. بعد المتوازية العينات قد تكون مجمعة قبل تلوين الأجسام المضادة، وهي العملية التي تضمن ملطخة جميع العينات على حد سواء. لتقليل الخطأ التجريبي، فإنه من الحكمة أن الباركود وتجميع أي عينات التي سيتم مقارنة مباشرة مع بعضها البعض. حاليا توجد عدة طرق لالمتوازية عينات للكتلة تحليل الخلوي 5، 6، 7، يتم عرض اثنين منها هنا (انظر أدناه). مع reagen متاح حاليانهاية الخبر أنه من الممكن تحديد وفرة من 38 أهداف الأجسام المضادة، وتحديد الخلايا في مرحلة S-10، تمييز الخلايا الحية والميتة 8 وقياس مستويات الخلايا من نقص الأكسجين 11 في تجربة المضاعفة من عينات متعددة. هذه القدرة على جمع البيانات خلية واحدة عالية المعلمة للسكان خلية كبيرة تمكن التنميط محسنة من السكان الخلية غير متجانسة للغاية وأنتجت بالفعل عددا من الأفكار البيولوجية الجديدة 12 و 13 و 14 و 15 و 16. تقطير البيانات المعقدة الناتجة على المعلومات التأويل قد يتطلب استخدام الخوارزميات الحسابية بما في ذلك شجرة الامتداد التقدم من كثافة الأحداث تطبيع (SPADE) 17 و 18 viSNE. تقدم هذه المقالة الوصولنظرة عامة عن كيفية تصميم وتنفيذ كتلة الخلوي التجربة ويقدم التحليل الأساسي للكتلة الخلوي البيانات.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>Stem Cell technologies</td><td>05850</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Soluble to 25&amp;nbsp;mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2&#039;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Soluble to 74&amp;nbsp;mg/mL in 0.2&amp;nbsp;N NaOH</td></tr><tr><td>Rhodium 103 intercelating agent</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Chill at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL round bottom tubes</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &amp;#956;m filter cap tubes</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ four element calibration beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation for mass cytometry analysis

كتلة يستخدم الخلوي الأجسام المضادة مترافق مع تسميات المعادن الثقيلة، وهو النهج الذي زاد بشكل كبير من عدد من المعلمات والفرص المتاحة لتحليل عميق إلى ما وراء ما هو ممكن مع تدفق القائم على مضان التقليدية الخلوي. كما هو الحال مع أي تكنولوجيا جديدة، وهناك خطوات الهامة التي تساعد على ضمان الجيل موثوق للبيانات عالية الجودة. المقدمة هنا هو بروتوكول الأمثل الذي يشتمل على تقنيات متعددة لتجهيز عينات من الخلايا لتحليل الخلوي الجماعي. سوف الأساليب المذكورة هنا تساعد المستخدم تجنب المخاطر المشتركة وتحقيق نتائج متسقة عن طريق تقليل التباين، مما قد يؤدي إلى عدم دقة البيانات. لإعلام التصميم التجريبي، وتغطي الأساس المنطقي وراء الخطوات الاختيارية أو بديلة في البروتوكول وفعاليتها في كشف نتائج جديدة في علم الأحياء من نظام يجري التحقيق فيها. وأخيرا، يتم تقديم بيانات تمثيلية لتوضيح النتائج المتوقعة من PRESENTE تقنياتد هنا.

بروتوكول المعروضة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمجموعة متنوعة واسعة من عينات خلايا مستنبتة والابتدائية مع تعديلات طفيفة فقط. تبعا لمتطلبات التجربة، فإنه لا يمكن أن يؤديها بطريقة نموذجية عند بعض العناصر، مثل المتوازية أو سطح الخلية تلطيخ، ليست ضرورية. المستخدمة في مجملها هذا البروتوكول يتيح إعداد كتلة المضاعفة الخلوي عينات المسمى لتحديد السكان ميت استبعاد الخلية، S-مرحلة والملون لتقدير حجم ما يصل الى 38 اهداف الأجسام المضادة. وصفت النتائج المتوقعة التي تنتجها الطرق الموضحة في هذا البروتوكول (الشكل 2) في الشكل (3). على جمع البيانات، وتطبيع كثافة إشارة استنادا إلى شدة حبة معايرة لا يمكن أن يؤديها في داخل البرنامج الخلوي الجماعي. وبعد التطبيع، صناعة تج البيانات الأوليةssing لإزالة حبات المعايرة، بوابة على الخلايا وحيدة وإزالة الخلايا الميتة يمكن القيام بها يدويا باستخدام أي برنامج قادر على تحليل التدفق الخلوي البيانات. إزالة من الخرز المعايرة يمكن القيام بها يدويا عن طريق المعزولة على السكان Ir191 + Ce140- (الشكل 3A) أو مع خوارزمية MATLAB أساس 20. أحداث وحيدة الخلية (الخطوط العريضة السوداء، الشكل 3B) يمكن بوابات أثناء إزالة الحطام وخلية multiplets، التي تبوب على مؤامرة ذو محورين من Ir193 وطول الحدث (الشكل 3B). وضع العلامات سيسبلاتين من الخلايا الميتة يمكن استخدامها لقياس كمية من موت الخلايا. أظهرت أمثلة العينات مع انخفاض (الشكل 3D) وارتفاع (الشكل 3E) كميات من الخلايا الميتة. الخلايا الميتة يمكن إزالتها من البيانات المعزولة من السكان Pt198 + (الشكل 3E). المتوازية من العينات، سواء مع monoisotopic سيسبلاتين أو البلاديوم الكواشف، والنتائج في فصل واضح في ساmples داخل المعلمات المتوازية (الشكل 3C)، والذي يسمح الخلايا ليتم تعيين لهوية العينة الأصلية. طرق إضافية اختيارية، مثل تعاطي المخدرات بالحقن وضع العلامات، وتسمح للكشف عن فئات معينة من السكان، على سبيل المثال، خلايا S-المرحلة (الشكل 3F). وبعد تطبيع الأولي، debarcoding والمحاصرة، ويمكن تحليل البيانات الأبعاد عالية باستخدام مجموعة متنوعة من الخوارزميات بما في ذلك SPADE 17 وعدة أشخاص آخرين مصممة لكتلة الخلوي تحليل البيانات والتصور 18. خوارزميات مثل SPADE تأخذ البيانات الأبعاد عالية، والتي يمكن أن يكون من الصعب تفسير لأنه لا يمكن تصور مباشرة في ولاية الأبعاد عالية، وتولد تمثيل الأبعاد السفلي من البيانات، التي هي أكثر قابلية لالتفسير البصري (الشكل 3G). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54394/54394fig1.jpg"/&gt; الشكل 1: المبادئ الأساسية للكتلة الخلوي القياس. إعداد عينات من الخلايا لكتلة تحليل الخلوي ويشمل خلايا تلطيخ مع الأجسام المضادة المسمى مع النظائر معدنية معظمها من سلسلة اللانثينيدات من العناصر. في هذا المخطط هو المسمى كل الأجسام المضادة التي أثيرت ضد حاتمة محددة نظير امتلاك الكتلة الذرية فريدة من نوعها، مثل السمريوم 154. الأجسام المضادة ضد الحواتم التي السطح، حشوية، لونين النووي أو محلية يمكن أن يحتمل استخدامها. يتم حقن الخلايا المسمى ويرش من خلال كتلة الخلوي البخاخات كما قطرات خلية واحدة حيث يتم المتأينة من قبل الشعلة الأرجون البلازما. تجريد سحابة الجسيمات الناتجة من ذرات كتلة منخفضة من خلال مرشح رباعي كتلة بينما يتم قياس وفرة أكبر أيونات الكتلة الذرية التي كتبها كاشف. الكمية المقاسة من كل أيون الشامل فريد يتوافق مع وفرة الخلوية من حاتمة الهدف يرتبط الجسم المضاد الخاصة به. في حين أن ل النظريimit أكثر من 100 المعلمات يمكن أن يكون كميا باستخدام هذه المنهجية، الكواشف الحالية المتاحة تجاريا تسمح الكشف عن أكثر من 40 المعلمات في الخلية. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54394/54394fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54394/54394fig2.jpg" /> الشكل 2: مخطط سير العمل من إجراء التجارب والخطوات الاختيارية. تصوير الخطوات الرئيسية المشاركة في إعداد الخلايا لمدة الخلوي كتلة البروتوكول. يشار إلى الخطوات الاختيارية من قبل صناديق البرتقال. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54394/54394fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54394/54394fig3.jpg" /> الشكل (3)مثال: البيانات التي تم إنشاؤها من م الحمار تحليل الخلوي. (A) قطعة ذو محورين تبين فصل الخلايا (عالية Ir191، وانخفاض Ce140)، والخرز (منخفض Ir191، وارتفاع Ce140) والحلل حبة خلايا (عالية Ir191، وارتفاع Ce140). (B) مؤامرة ذو محورين تظهر مظهر المتوقع Ir193 مقابل طول الحدث. ويرد النابضة من خلايا مفردة الذي يزيل الحطام الخلوي والخلية multiplets. (C) مؤامرة ذو محورين تظهر عرض مثال على قناتين الجماعية من المتوازية سيسبلاتين. (D - E) بيانات مثال من سيسبلاتين لايف / تلطيخ الميت للعينات التي تحتوي على نسبة منخفضة (D) ونسبة عالية (E) من الخلايا الميتة. (F) مؤامرة ذو محورين الخلايا H9 HESC المسمى مع إيدو لتمييز الخلايا في S-مرحلة والأجسام المضادة ضد السيكلين B1 إلى مزيد من التمييز دورة الخلية. (G </stرونغ&gt;) N س N قطعة من البيانات من كتلة 35 الضد الخلوي تجربة hESCs وشجرة SPADE تمثيلية شيدت من علامات البروتين والملونة التي كتبها فرة من إحدى المعلمات قياس. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54394/54394fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis at JoVE.com

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

sample-preparation-for-mass-cytometry-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

16.0K Views.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Video: Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Bioengineering

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Developmental Biology

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Medicine

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming &#34;units&#34; known as BFU-e and CFU-e. Until recently, methods for the direct prospective and complete isolation of pure BFU-e and CFU-e progenitors from freshly isolated adult mouse bone marrow were not available. To address this gap, a single-cell RNA-seq (scRNAseq) dataset of mouse bone marrow was analyzed for the expression of genes coding for cell surface markers. This analysis was combined with cell fate assays, allowing the development of a novel flow cytometric approach that identifies and allows the isolation of complete and pure subsets of BFU-e and CFU-e progenitors in mouse bone marrow or spleen. This approach also identifies other progenitor subsets, including subsets enriched for basophil/mast cell and megakaryocytic potentials. The method consists of labeling fresh bone marrow or spleen cells with antibodies directed at Kit and CD55. Progenitors that express both these markers are then subdivided into five principal populations. Population 1 (P1 or CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) contains all of the CFU-e progenitors and may be further subdivided into P1-low (CD71med CD150high) and P1-hi (CD71high CD150low), corresponding to early and late CFU-e, respectively; Population 2 (P2 or BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) contains all of the BFU-e progenitors; Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is enriched for basophil/mast cell progenitors; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is enriched for megakaryocytic progenitors; and Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) contains progenitors with erythroid, basophil/mast cell, and megakaryocytic potential (EBMP) and erythroid/ megakaryocytic/ basophil-biased multipotential progenitors (MPPs). This novel approach allows greater precision when analyzing erythroid and other hematopoietic progenitors and also allows for reference to transcriptome information for each flow cytometrically defined population.

Here, we describe a novel flow cytometric method for prospective isolation of early burst-forming unit erythroid (BFU-e) and colony-forming unit erythroid (CFU-e) progenitors directly from fresh mouse bone marrow and spleen. This protocol, developed based on single-cell transcriptomic data, is the first to isolate all the tissue's erythroid progenitors with high purity.

تحديد وعزل وحدة تشكيل الانفجار ووحدة تشكيل المستعمرات أسلاف الإريثرويد من أنسجة الفأر عن طريق قياس التدفق الخلوي

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Immunology and Infection

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

دراسات التمثيل الغذائي منخفضة المدخلات في أنواع خلايا الفئران

Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule intermediates. However, obtaining accurate and reliable measurements of cellular metabolism, particularly in rare cell types like hematopoietic stem cells, has traditionally required pooling cells from multiple animals. A protocol now enables researchers to measure metabolites in rare cell types using only one mouse per sample while generating multiple replicates for more abundant cell types. This reduces the number of animals that are required for a given project. The protocol presented here involves several key differences over traditional metabolomics protocols, such as using 5 g/L NaCl as a sheath fluid, sorting directly into acetonitrile, and utilizing targeted quantification with rigorous use of internal standards, allowing for more accurate and comprehensive measurements of cellular metabolism. Despite the time required for the isolation of single cells, fluorescent staining, and sorting, the protocol can preserve differences among cell types and drug treatments to a large extent.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير تحليل الأيض للخلايا الجذعية المكونة للدم النادرة 

Here, we present a protocol to accurately and reliably measure metabolites in rare cell types. Technical improvements, including a modified sheath fluid for cell sorting and the generation of relevant blank samples, enable a comprehensive quantification of metabolites with an input of only 5000 cells per sample.

الأيض المستهدف على الخلايا الأولية النادرة

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

تحديد وعزل وحدة تشكيل الانفجار ووحدة تشكيل المستعمرات أسلاف الإريثرويد من أنسجة الفأر عن طريق قياس التدفق الخلوي

تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

الأيض المستهدف على الخلايا الأولية النادرة

الأيض المستهدف على الخلايا الأولية النادرة

الأيض المستهدف على الخلايا الأولية النادرة

الفينوتينوبينج المناعي وفرز الخلايا من MKs الإنسان من المصادر الأولية البشرية أو المتمايزة في المختبر من السلف الهيماتوبويات