Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

وأجري الجزء الحيواني من هذه الدراسة في وحدة أبحاث التمثيل الغذائي في جامعة ألبرتا، ادمونتون، كندا، مع كل الإجراءات التجريبية الحيوانية المعتمدة (بروتوكول # AUP00000131) من جامعة ألبرتا رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام، والحيوانات رعايتهم وفقا إلى المجلس الكندي للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان (1993). 1. إنتاج الأجنة، عزل الحمض النووي الريبي مجموع والدناز العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبروتوكولات التجريبية الحيوانية وجمع الأجنة الرجوع في المنشورات السابقة لدينا 17، 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع والمفاجئة تجميد الأجنة مرحلة مماثلة من كل بقرة في النيتروجين السائل ومن ثم الحفاظ على -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي الريبي مجموع طريق RNA عدة الاستخراج القائم على العمود الذي تمكن من استخراج الحمض النووي الريبي من عينات بيكو النطاق (مجموعة مواد متوفرة في قائمة المواد). تحتوي الموصى بها عدة: ملاحظة: تكييف العازلة، استخراج BUFفر، و 70٪ إيثانول، مخزن اغسل 1، مخزن اغسل 2، شطف العازلة، والأعمدة تنقية RNA مع أنابيب جمع وأنابيب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر استخراج العازلة إلى أنبوب يحتوي على الأجنة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية. أنبوب الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 2 دقيقة لجمع استخراج الخلايا في أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 250 ميكرولتر تكييف عازلة على الغشاء العمود تنقية التصفية. احتضان العمود تنقية RNA مع تكييف العازلة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي العمود تنقية في أنبوب جمع في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 10 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في خليط من استخراج الحمض النووي الريبي العازلة والأجنة. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. خليط ماصة في العمود تنقية شروطا مسبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لربط الحمض النووي الريبي، الطرد المركزي العمود تنقية لمدة 2 دقيقة في 100 x ج وتابع على الفور من قبل الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 30 ثانية لإزالة التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 10081؛ ل من الاحتياطي اغسل 1 في العمود تنقية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8000 ز س. ويوصى الدناز العلاج إذا أداء النسخ العكسي أو التضخيم بعد عزل الحمض النووي الريبي: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم الحمض النووي الجيني الحق بعد خطوة 1.8. ملاحظة: الموصى به عدة الدناز متوفرة في قائمة المواد. يحتوي على عدة الموصى بها: أنا الدناز محلول المخزون والاحتياطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الدناز حضانة خليط طريق خلط 5 ميكرولتر الدناز أنا حل الأسهم مع 35 ميكرولتر العازلة. مزيج من قبل قلب بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ميكرولتر الدناز حضانة خليط 40 مباشرة في غشاء عمود تنقية. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 40 ميكرولتر غسل العازلة 1 في غشاء عمود تنقية ثم الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 15 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر غسل العازلة 2 في العمود تنقية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة آخر 100 ميكرولتر غسل العازلة 2 في العمود تنقية وأجهزة الطرد المركزيلمدة 2 دقيقة في 16000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العمود تنقية ل0.5 أنبوب جديد مل microcentrifuge. ماصة 11 ميكرولتر من شطف العازلة مباشرة على الغشاء العمود تنقية. لضمان أقصى قدر من الاستيعاب للشطف العازلة في غشاء، لمس بلطف غيض من ماصة على سطح الغشاء في حين الاستغناء عن شطف العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العمود لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 1000 x ج لتوزيع الاحتياطي شطف في العمود، ثم تدور لمدة 1 دقيقة في 16000 x ج لأزل الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة bioanalyzer وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لتقييم نوعية الحمض النووي الريبي وكمية 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين عينة الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol> 2. الحمض النووي الريبي التضخيم وصفها لتحليل ميكروأري ملاحظة: للحصول على أول المستخدم وقت العمل للإجراءات التضخيم RNA ووضع العلامات، واستخدام خمسة نانوغرام من ارتفاع في الحمض النووي الريبي الونانوغرام مع العينات آرنا الفعلية لمراقبة وقياس ومراقبة الجودة لتضخيم الحمض النووي الريبي والتهجين. ارتفاع في مزيج RNA يحتوي على عشرة في المختبر توليفها، ونصوص مذيل بعديد الأدينيلات في نسب محددة مسبقا. عندما إجراء العملية بشكل صحيح، والنصوص وصفت هجن خصيصا فقط لتحقيقات الرقابة التكميلية في المصفوفات ويمكن تفحص بيانات لتتبع ضمان مراقبة الجودة مع الحد الأدنى الذاتي أو عبر التهجين. مزيد من التفاصيل وصف بشأن إجراء ارتفعت في شدة الرقابة والتطبيع بعد مسح تحليل مجموعة والبيانات الرجوع إلى الإصدارات السابقة 20 و 21. وبالنظر إلى الإجراء التالي لمستخدمي ميكروأري الروتيني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 خريج جودة عالية عينة الحمض النووي الريبي (RNA عدد النزاهة (رين) القيمة على الأقل&gt; 7.0) في إجمالي حجم 10-11 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم عينات الحمض النووي الريبي مع عدة التضخيم أن تكون قادرة علىالعمل مع عينات بيكو الحجم (اقل من 100 خريج). ينصح المعلومات عدة التضخيم المتاحة في قائمة المواد ويتبع تعليمات الشركة الصانعة دون أي تعديل: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكميات القائم على مضان لتقييم الملف الشخصى نطاق حجم آرنا تضخيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة طيفي (استنادا إلى الامتصاصية في 260 و 280 نانومتر) لقياس تركيز آرنا تضخيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين آرنا تضخيمها في -80 درجة مئوية حتى على استعداد لوضع العلامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي تضخيمها لوضع العلامات الفلورية وفقا لدليل المستخدم ULS آرنا العلامات عدة. ملاحظة: منذ Cyanine 547 و 647 Cyanine صبغة حساسة للالصور التدهور وCyanine 647 صبغ تتحلل بسهولة عن طريق الأوزون، وإجراء وسم تجري في كمية ضئيلة من الضوء وتحت بيئة خالية من الأوزون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مربع الأوزون (الشكل 1A) حتى مستوى الأوزون هو 0.001 جزء من المليون. </li><lط&gt; هل الإعداد رد فعل داخل منطقة الجزاء الأوزون (الشكل 1B) وذلك بإضافة 2 ميكرولتر من Cyanine 547 أو Cyanine 647، 2 ميكرولتر من العازلة وضع العلامات، ومن ثم التكيف مع الحجم النهائي من 20 ميكرولتر مع ريبونوكلياز خالية من المياه تحت safelight. إضافة فلتر غرفة مظلمة لمصدر الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف واحتضان الأنابيب في thermocycler في 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. مكان عينات على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل. تدور باستمرار لجمع المحتوى من الأنابيب قبل الشروع في عدة استخراج الحمض النووي الريبي، باستثناء الخطوات المتعلقة العلاج الدناز (1،9 حتي 1،11)، لتنظيف الحمض النووي الريبي تضخيمها وصفت قبرصي صبغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة معمل لقياس وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي تضخيمها وصفت والحفاظ على آرنا المسمى في -80 درجة مئوية كحد أقصى لمدة 3 أيام قبل الاستخدام. </li></ol> 3. ميكروأري التهجين وغسل ملاحظة: يتم تكييفها الخطوات الهامة التالية وفقا لبروتوكول تحليل اللونين القائم على ميكروأري التعبير الجيني (الإصدار6.5، مايو 2010). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كمية مساوية من 825 نانوغرام من كل Cyanine 547- وCyanine 647 المسمى آرنا وتخلط مع 25X تجزئة و 10x مخازن الحجب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين الخليط في 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وباردة على الجليد لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مبلغ مساو من العازلة التهجين 2X و تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة، ثم خليط جاهز للتهجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 100 ميكرولتر من الخليط على الشريحة مجموعة وختم الشريحة داخل غرفة التهجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل غرفة تجميعها في الفرن التهجين لمدة 17 ساعة عند 65 درجة مئوية الدورية في 10 دورة في الدقيقة في الفرن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المصفوفات وفقا لبروتوكول العلاج حماية طبقة الأوزون عن طريق غمس في تحقيق الاستقرار وتجفيف حل لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة صفائف من الحل وتأكد من أن السطح مجموعة جاف مع عدم وجود جزيئات الغبار </li></ol> 4. الضوئي ميكروأري الشريحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على المصفوفات في مكان مظلم وتشغيل scannإيه حتى انها مستعدة لاستخدام (15 دقيقة وقت الانتظار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الباركود مجموعة على اليسار، في الماسح الضوئي وبدء المسح الضوئي. هل تحليل البقعة وفقا لدليل مستخدم البرنامج وحفظ البيانات و(GPR) تنسيق الملف. </li></ol> 5. التحليل الإحصائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل البرنامج FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php انقر على &quot;البيانات الخام استيراد&quot; وتحميل الملفات GPR إلى FlexArray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تطبيع والتحليل الإحصائي إذا لزم الأمر عن طريق اتباع التعليمات. ملاحظة: احسب عتبة لاختيار بقعة إيجابية في هذه الدراسة كما وصفه سابقا 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المنسدلة دليل من المشاهد مؤامرة من FlexArray لعرض جميع البقع المهجنة والإشارات الخلفية. ملاحظة: صورة مماثلة من ارتفعت في الضوابط بعد التهجين لميكروأري يمكن أن ينظر في دراسة سابقة (8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخترتطبيع اللوس ضمن مجموعة التالية من قبل quantile بين عملية صفائف التطبيع من FlexArray المنسدلة دليل وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير جميع البيانات تطبيع من FlexArray إلى ملف إكسل لمزيد من الاستخدام. </li></ol> 6. تحليل المعلومات البيولوجية الشرح الأصلي للتسلسل التحقيق من النصوص-جنين محدد الأبقار وقد وصفت (BESTv1) ميكروأري قبل 8. في الدراسة الحالية، تم الحصول على 20403 الرموز جين فريدة (ع) ( <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">الملحق FILE1</a> ) من خلال مختبر نظام إدارة المعلومات EmbryoGENE (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). قائمة 6765 الجينات الفريدة ( <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">الملحق FILE2</a> تم اختيار) ويتفق مع الإشارات كلها إيجابية بعد عملية ميكروأري التطبيع (الخطوة 50.5) من الأبقار يوم 7 أجنة الجينات الشخصية التعبير. تم حساب عتبة إشارة إيجابية على أساس نشر الأسبق 16 من قوة إشارة قيمة A. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء تحليل وظيفي مع كوجر (البروتين خلال تحليل التطوري العلاقات) نظام تصنيف 23، 24، افتح الرابط التالي (http://www.pantherdb.org/about.jsp). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل قائمة من 6765 GS-جنين محددة لتحديد عملية بيولوجية معينة أثناء التطور الجنيني باستخدام اختبار زيادة تمثيل الإحصائي واستخدام الإعداد الافتراضي لبوس الثور (جميع الجينات في قاعدة البيانات) عن قائمة مرجعية 25. ملاحظة: هذا يسمح تحديد العمليات المتعلقة التنموية، من حيث GO التي هي الإفراط إحصائيا أو تحت أعرب باستخدام اختبار ذي الحدين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين عتبة ف قيمة في &lt;0.05 كما الافتراضية البرمجيات. البيانات التي يمكن تحميلها والمعرضrted إلى ملف إكسل لمزيد من اختيار 16. </li></ol>

<ol><li>Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+in+dairy+cows%3A+bridging+the+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Fertility in dairy cows: bridging the gaps.</a> Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).</li>
<li>Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+in+dairy+cows+managed+under+pastoral+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions.</a> Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).</li>
<li>Wrenzycki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+culture+system+and+protein+supplementation+on+mRNA+expression+in+pre-implantation+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos.</a> Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).</li>
<li>Menezo, Y. J., Herubel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+bovine+models+for+human+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse and bovine models for human IVF.</a> Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
<li>Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+the+cancer+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of the cancer transcriptome.</a> Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).</li>
<li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+resources+to+obtain+a+comprehensive+survey+of+the+bovine+embryo+transcriptome+through+deep+sequencing+and+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays.</a> Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).</li>
<li>Nygaard, V., Hovig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+available+for+profiling+small+samples%3A+a+review+of+sample+amplification+technology+when+combined+with+microarray+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling.</a> Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).</li>
<li>Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isothermal%2C+linear+nucleic+acid+amplification+systems+for+highly+multiplexed+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications.</a> Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).</li>
<li>Phillips, J., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+RNA+Amplification%3A+A+linear+amplification+method+for+analyzing+the+mRNA+population+from+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells.</a> Methods. 10 (3), 283-288 (1996).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+aRNA+production+during+T7+amplification+to+prevent+the+loss+of+sample+representation+during+microarray+hybridization+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 65(2009).</li>
<li>Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Linkage+System%3A+versatile+nucleic+acid+labeling+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Re.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique.</a> Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+a+stable+methodological+basis+for+comparing+transcript+abundance+of+developing+embryos+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays.</a> Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).</li>
<li>Tsoi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+porcine+%28Sus+scofa%29+embryo-specific+microarray%3A+array+annotation+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation.</a> BMC Genomics. 13, 370(2012).</li>
<li>Salehi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/rd/rdv26n1ab208">Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).</li>
<li>Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diets+enriched+in+unsaturated+fatty+acids+enhance+early+embryonic+development+in+lactating+Holstein+cows%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows.</a> Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).</li>
<li>Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf</a> (2016).</li>
<li>Kerr, K. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17915030">Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray.</a> BMC Bioinformatics. 8, 371(2007).</li>
<li>Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wholly+defined+Agilent+microarray+spike-in+dataset%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset.</a> Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).</li>
<li>Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+and+known+oocyte-specific+genes+using+complementary+DNA+subtraction+and+microarray+analysis+in+three+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species.</a> Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).</li>
<li>Thomas, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER%3A+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li>
<li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PANTHER+database+of+protein+families%2C+subfamilies%2C+functions+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways.</a> Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).</li>
<li>Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+gene+transcript+abundance+in+bovine+fertilized+and+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).</li>
<li>Gilbert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+products+fluctuation+during+bovine+pre-hatching+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).</li>
<li>Vallee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+bovine+embryo+transcript+profiles+during+early+in+vivo+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development.</a> Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).</li>
<li>Dafforn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+mRNA+amplification+from+as+little+as+5+ng+total+RNA+for+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis.</a> Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).</li>
<li>Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaujean%2C+N+%22Studying+Bovine+Early+Embryo+Transcriptome+by+Microarray%22">Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray</a>. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

المشكلة الأولى لأداء تحليل ميكروأري استخدام يوم واحد 7 أجنة الأبقار هو عدم الحصول على كميات كافية من الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية لدراسة التعبير الجيني. لا ينصح استخراج الحمض النووي الريبي الفينول التقليدي / الكلوروفورم وطريقة الإيثانول هطول الأمطار ليوم 7 الأ...

فقدان الجنينية المبكرة في الأبقار المنتجة العالية هي واحدة من التحديات الرئيسية في صناعة الالبان 1 و 2. أصبح الأبقار نموذج مثير للاهتمام لدراسة تطور سابق للانغراس الجنين الإنسان بسبب عملية تنموية مماثلة من 3 و 4. ومع ذلك، مطلوب مزيد من البحوث لدينا فهم أفضل عن جينات لها دور في التطور الجنيني المبكر البقري. بعد عشرين عاما على تكنولوجيا متطورة للالأولى وضعت في عام 1995 5، وتطوير التكنولوجيا التحقيق تلفيق تقليل أخطاء الطباعة أكثر تطورا وتقلبه من رقائق مجموعة داخل وبين منصات ميكروأري مختلفة 6. وأسفرت تحسين تكنولوجيا متطورة في تطبيق على نطاق واسع لهذه التكنولوجيا في البحوث السريرية 7 و في الآونة الأخيرة، في ف الجنين في وقت مبكرتقييم ينشيء 8. كمية كبيرة من المواد اللازمة لتكنولوجيا متطورة للهو السبب الرئيسي وراء فشل تكنولوجيا متطورة في البداية للدخول في عدد من المجالات البحثية مثل التطور الجنيني المبكر. وفي الآونة الأخيرة، تم تحسين أساليب RNA التضخيم لتضخيم خطيا RNA تصل إلى مستوى ميكروغرام من دون نانوغرام بدءا مادة RNA 9. هناك عدة مجموعات الحمض النووي الريبي التضخيم التجارية المتاحة في السوق. ومع ذلك، ترتبط أكثر شعبية في مجموعات متطورة لRIBO-واحدة التمهيدي متساوي التضخيم 10 و T7 المروج دفعت 11 الأساليب. يستخدم الأكثر شعبية التضخيم العقاقير الحمض النووي الريبي في النسخ المختبر مع جزئية DT التمهيدي ربط المروج T7 في &quot;نهاية 12 5. وتسمح هذه التكنولوجيا الحفاظ على معظم النصوص مكافحة الشعور التمثيلية بعد الخطي التضخيم وأو صفائف التهجين 13. وقد تم تكييف هذا الأسلوب لتضخيم مستوى بيكو غرام من الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من الأبقار الجنين 8. نظام الربط العالمي (ULS) هو طريقة وضع العلامات التي تضم بشكل مباشر على الحمض النووي الريبي أو تضخيم مع مرتبطة البلاتين صبغة الفلورسنت إما Cyanine 547 أو 647 Cyanine، من خلال تشكيل السندات التنسيقي على موقف N7 من جوانين 14. وقد تم تكييف هذه الطريقة في البحث الأجنة لتوليد أكثر استقرارا تضخيم آرنا دون تعديل بالمقارنة مع aminoallyl تعديل لآرنا الناتجة عن طريقة الأنزيمي 15. وقد تم تكييف أساليب كلا صبغ واحد واثنين من الأصباغ وصفها باستخدام نظام الربط العالمي في ميكروأري. وكانت دراسة مقارنات ميكروأري كبيرة أن هناك علاقة جيدة جودة البيانات بين منصات مجموعة واحدة وهما لونا 6. في الآونة الأخيرة، على حد سواء T7 محرك المروجوقد تم تطوير أساليب ن العقاقير RNA التضخيم وULS وضع العلامات لتوفير بروتوكول أكثر موثوقية لتوليد كمية كافية من جودة عالية وصفت المواد آرنا لميكروأري التهجين 8 و 16. ولذلك، فإن هذه الدراسة على بروتوكول لإظهار بعض الخطوات الهامة من استخراج الحمض النووي الريبي لتحليل البيانات المشاركة في ميكروأري اللونين استخدام يوم واحد 7 أجنة الأبقار كمثال على ذلك.

<table><tbody><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instruments</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>RNA Screen Tape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>ULS Fluorescent Labeling Kit</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Custom Gene Expression Microarrays</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression wash buffer 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression wash buffer 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hi-RPM Hybridization buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Part #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Fragment buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x GE Blocking Agent</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Stabilization and drying solution</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Part #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide</td></tr><tr><td>Two-Color RNA Spike-In Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B array scanner</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>Ozone Free Box</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>GAL file</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptome profiling of in-vivo produced bovine pre-implantation embryos using two-color microarray platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

ويرد نتيجة ممثل من الحمض النووي الريبي مجموع وتضخيمها آرنا من يوم 7 أجنة الأبقار في الشكل (3) وتلخيصها في الجدول 1. ويمكن تقييم سلامة الحمض النووي الريبي والشخصية بعد استخراج ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform at JoVE.com

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

7.7K Views.  University of Alberta. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Video: Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

التعبير عن البروتينات الفلورية في<em&gt; السهيم</em&gt; من جانب مرنا حقن البويضات غير المخصبة في

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

حشوية حقن مكروي في الثروة الحيوانية بيضات ملقحة بمساعدة الليزر

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genetics

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, the ability to determine an embryo&#39;s sex is necessary in many experiments particularly regarding early development. The present protocol demonstrates an inexpensive, rapid and non-toxic preparation of pig genomic DNA for use with PCR. Day 30 embryos must be humanely collected according to the guidelines established by Institutional Animal Policy and Welfare Committees for the present protocol. The preparation of the whole embryo for this PCR based sexing technique simply involves grinding the frozen embryo to a fine powder using a pre-chilled mortar and pestle. PCR-quality DNA is released from a small amount of embryo powder by applying a hot incubation in an alkaline lysis reagent. Next, the DNA solution is mixed with neutralization buffer and used directly for PCR. Two primer pairs are generated to detect specific sex determining region of the Y- chromosome (SRY) and ZFX region of the X- chromosome with high accuracy and specificity. The same protocol can be applied to other elongated embryos (Day 10 to Day 14) earlier than Day 30. Also, this protocol can be carried with 96-welled plates when screening a large number of embryos, making it feasible for automation and high-throughput sex typing.

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

دقيقة والفينول الحرة الحمض النووي مبالغات من يوم 30 خنزيري الأجنة بواسطة PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

تحديد برنامج ترجمة مرنا الأم أثناء النضوج في المختبر باستخدام اختبار مراسل Oocyte واحد

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Transcriptome على من التنميط

Summary

Explore More Videos

التعبير عن البروتينات الفلورية في