Name: surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

ملاحظة: بعض الخطوات للبروتوكول تتطلب أدناه العمل في غطاء الدخان نظيفة. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب طريقة المجهر تشريح الخميرة الرباعيات مجهزة هدفا بعد 10X العمل الطويلة لمراقبة spheroplasting. يجب تعيين المجهر يصل في غطاء محرك السيارة في وقت مبكر. إزالة الذراع micromanipulator وحامل لوحة من نطاق ووضع هذه العناصر في مكان آمن بعيدا عن منطقة العمل. 1. إعداد Spheroplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخميرة في ظل ظروف المطلوب. استخدام حوالي 2 × 10 8 خلايا لكل عينة، على سبيل المثال 4 مل من ثقافة في OD600 1.4 = 5 × 10 7 خلية / مل. على الرغم من معالجته فورا من عينات قد يكون من الأفضل في بعض الحالات، بالنسبة لمعظم التطبيقات، قسامات خلية يمكن تخزينها على الجليد لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل أن يتم معالجتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وتدور في أجهزة الطرد المركزي السريري في تحديد 5 (2345 دورة في الدقيقة / 857.5 x ج) لمدة 3 دقائق لخلايا بيليه. </lI&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب المتوسطة مع الحرص على عدم فقدان الخلايا من بيليه. بلطف resuspend الخلايا في 1 مل العازلة ZK ثم إضافة 40 ميكرولتر 1 M dithiothreitol (DTT). احتضان 2 دقيقة مع خلط لطيف. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات resuspend في 1 مل العازلة ZK. إضافة 5 ميكرولتر من حل الطازجة من 100T zymolyase التي تم خلطها بشكل تام. احتضان لمدة 20-30 دقيقة في 30 ° C لإزالة جدار الخلية وإنتاج spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقايسة قطرات 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة المجهر لتحديد ما إذا كان spheroplasting كاملة. خلايا ينظر تحت المجهر تشريح دون ساترة. يجب أن تظهر خلايا منتفخة ومستديرة بدلا من مستطيل قليلا، وينبغي أن ليز التالية إضافة 20 ميكرولتر من الماء. إذا فشلت الخلايا لليز، والعودة العينة إلى 30 درجة مئوية، وإعادة فحص-كل 10 دقيقة حتى لوحظ المياه الناجم عن تحلل بسهولة. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend برفق ويغسل خلية بيليه طن 2.5 مل MES البارد / العازلة السوربيتول. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). و resuspend بلطف بيليه خلية في 300-400 MES الباردة ميكرولتر / العازلة السوربيتول. يمكن أن تبقى الخلايا على الجليد في هذه المرحلة لعدة ساعات. </li></ol> 2. كروموسوم نشر ملاحظة: الواجهات الزجاجية التي تقوم عليها سيتم الشرائح أو بإحدى هاتين العقوبتين تنتشر الكروموزومات coverslips-يجب أن يكون مستعدا في وقت مبكر. يجب أن يغطس كل شريحة أو ساترة في الماء، ثم ETOH، ثم يترك ليجف، ومصقول مع ورقة العدسة. إذا كان سيتم نشر الكروموسومات coverslips على أنه ينبغي اضافته ساترة لشريحة بشريط لاصق أو الاسمنت والمطاط. ما لم يذكر غير ذلك، فإن بقية بروتوكول يصف نشر على أي شريحة أو ساترة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor P20، الماصة 20 ميكرولتر من تعليق خلية على سطح شريحة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor P200، إضافة 40 ميكرولتر من 3٪ PFA / محلول السكروز وتخلط بلطف solutioن من قبل &quot;يحوم&quot; الشريحة مع اليد حتى تختفي خطوط انعراجي. ضع الشريحة تحت المجهر والتأكد من أن الخلايا هي في التركيز. يجب أن يكون الحل PFA أعدت-الطازج في غطاء الدخان في يوم من الاستخدام. ملاحظة: إذا لم يتم فحص البروتين من الاهتمام من خلال الأسلوب السابق، فإنه من المستحسن لإعداد الشرائح إضافية باستخدام الحلول التي تحتوي على 2 و 4٪ PFA لتحديد ما إذا كان الإبقاء على البروتين حساس للشروط التثبيت. يتم استخدام 4٪ PFA حل / السكروز في الحالات التي يكون من المرغوب فيه تصور ميكروتثبول تويولين المرتبطة بها. العيب من تركيز تثبيتي العالي هو أن الكروموسومات ستكون &quot;underspread،&quot; يميل 2٪ PFA أيضا أن تسفر الكروموسومات &quot;underspread&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor P200، إضافة 80 ميكرولتر من 1٪ Lipsol، دوامة كما كان من قبل لخلط حلول تماما بقدر الإمكان، وبدء الموقت. إذا Lipsol غير متوفرة، 80 ميكرولتر 1٪ NP40 أو 80 ميكرولتر درهم 2 O قد يكوناستبدال (انظر ممثل النتائج، الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاهدة الخلايا بعناية وبلطف دوامة الشريحة كل 15 ثانية. عندما هي lysed حوالي 80٪ من الخلايا (اختفى) إيقاف الموقت، إزالة الشريحة مباشرة من المجهر، إضافة 80 ميكرولتر من PFA / محلول السكروز، ودوامة لخلط. تحلل ينبغي أن يحدث من ما بين 30 و 90 ثانية بعد بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت. ملاحظة: إذا أظهرت عدة شرائح تحلل في نفس الوقت تقريبا، يمكن للمرء أن يغفل في نهاية المطاف المراقبة المجهرية للفترة المتبقية من الشرائح وببساطة توقيت بعناية الفترة ما بين إضافة lipsol وإضافة قسامة النهائية من تثبيتي. ومع ذلك، هذا الخفض القصير هو موثوق بها فقط عند إعداد عدة شرائح من نفس العينة. فمن الأفضل لمراقبة تحلل من كل عينة مجهريا عند إعداد الشرائح المختلفة من عينات أخذت في أوقات مختلفة أو من ثقافات مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة على سطح مستو نظيفة وتنتشر السائل عبر surfac unfrosted كامل(ه) من الشريحة باستخدام جانب نظيفة، يمكن التخلص منها الماصة المراعي التي عقدت تحت الغضروف المفصلي من &quot;بركة&quot; ولكن فوق سطح الشريحة نفسها، أي. لا &quot;أشعل النار&quot; على سطح الشريحة مع الماصة. لا إعادة استخدام الماصة على الشرائح المختلفة لتجنب تلوث العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها في غطاء الدخان. والمكونات النووية غير قابلة للذوبان يستقر على سطح الشريحة وربط ذلك. للتجارب كبيرة، والتخطيط لاستخدام الفضاء للخطوة التجفيف هو المهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جفت مرة واحدة، ويتم الحصول على أفضل النتائج من خلال التقدم إلى المرحلة المناعية في نفس اليوم. ومع ذلك، فإن الحل السكروز المجففة يضمن انتشار الصبغيات في &quot;العسل&quot; الذي يسمح بتجميد عينات: يمكن نقل الشرائح إلى مربع الشريحة البلاستيكية وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة سنة. </li></ol> 3. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في 0.2٪ صور فلو لمدة 30 ثانية. لإزالة العسل. الشرائح الهزيل علىميزة، مع حافة يستريح على منشفة ورقية، لإزالة بقايا صور فلو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في TBS 1X لمدة 5 دقائق لغسل. إزالة السائل الزائد بالانحناء الشرائح على الحافة، ولكن لا تسمح لهم تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرائح متجمد حتى الجانب، الماصة 300 ميكرولتر TBS / BSA على الشريحة عبر الجزء unfrosted من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في غرفة رطبة في RT لمدة 15 دقيقة. (حاوية بلاستيكية كبيرة تصطف مع المياه المشبعة مناشف ورقية تحت لوحة معدنية أو بلاستيكية مربع الشريحة مثقب مع المناشف الورقية المشبعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف الشرائح التي يستريح على حافة قصيرة من الشريحة على منشفة ورقية ويميل الشريحة ضد الدعم المناسب (مثل أنبوب اختبار رف). لا تسمح السطح ليجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق على الفور 80 ميكرولتر من TBS / BSA العازلة التي تحتوي على التخفيف المناسب من الأجسام المضادة الأولية. إذا الأجسام المضادة يحد من استخدام 40 ميكرولتر و22 × 22 مم ساترة. لمصل الأرنب الخام، وهذا هو عادة بين 1/50 و 1/500 التخفيف. ملاحظة:أداء المعايرة للتحضير الأجسام المضادة الجديدة. يتم اختيار إعداد معظم المخفف التي تعطي إشارة عالية فوق الخلفية. للسيطرة على مستوى تلوين الخلفية، ينبغي إعداد نواة من سلالة متحولة الحذف المناسب و / أو الشرائح المكررة وينبغي ملطخة المصل قبل المناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المصقول 22 × 50 مم ساترة على الشريحة تجنب الفقاعات. القيام بذلك عن طريق الضغط على ساترة بين الإبهام والسبابة على طول الحافة الطويلة في مواقع بالقرب من حافة واحدة قصيرة. عقد ساترة على زاوية 30 درجة بالنسبة إلى الشريحة، يتم إنزال أقصى حافة قصيرة من الأصابع حتى يستقر على الشريحة فقط داخل حافة &quot;بركة&quot; الأقرب إلى المنطقة متجمد من الشريحة. ثم خفض ببطء ساترة في حركة سلسة حتى الأصابع عقد لمسة الشريحة على مقاعد البدلاء، ثم يفرج عنه. لا تحاول ضبط الموقف من ساترة بمجرد أن يهبط. ملاحظة: إذا تم إعداد ينتشر كروموسوم علىcoverslips ملحقة (وليس مباشرة على سطح شرائح)، وهذه عينة ساترة تظل الملصقة على الشريحة في جميع أنحاء تلطيخ والغسيل الخطوات. سيتم وضع ساترة إضافية على رأس ساترة عينة لتوزيعها بالتساوي على حل الأجسام المضادة خلال تلطيخ ومن ثم التخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في غرفة رطبة مختومة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد نقل حافة بلوري الشرائح إلى شريحة زجاجية تلطيخ الرف ويغرق في جرة تلطيخ التي تحتوي على TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع بلطف الشريحة صعودا وهبوطا لإزالة ساترة. ليس محاولة لاستخدام الكثير من القوة للقيام بذلك. تغسل الشرائح 2X 10 دقيقة بواسطة غمر في TBS. إزالة الشرائح من الرف واستنزاف السوائل الزائدة عن طريق لمس حافة منشفة ورقية. لا تدع سطح جاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل تحت ضوء مهزوما، إضافة على الفور 80 ميكرولتر TBS / BSA تحتوي على 1/1000 تخفيف أضعاف تألقي الضد الثانوية مترافق (أو 40 ميكرولتر مع 22 × 22 مم ساترة). إعلاند ساترة كما كان من قبل واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في غرفة رطبة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة coverslips كما كان من قبل، واستنزاف الشرائح، والسماح للسطح في الهواء الجاف ل1-2 ساعة في الظلام. الشرائح الهزيل على مناشف ورقية كما كان من قبل. ملاحظة: إذا تم تنفيذ نشر على ساترة محمولة، فصل ساترة من الشريحة قبل التجفيف. ثم يتم تجفيفها Coverslips كما هو موضح الشرائح في الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل تحت ضوء مهزوما، إضافة حوالي 30 ميكرولتر من تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي (ثلاث قطرات 10 ميكرولتر) ومن ثم خفض بعناية ساترة. إذا كان ينتشر هي coverslips على، ضع قطرات من تصاعد المتوسطة على شريحة نظيفة وخفض ساترة، الجانب كروموسوم إلى أسفل، على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تزال تحت ضوء مهزوما، الانتظار 2 دقيقة لساترة لتسوية وختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة. وضع الشرائح في مربع الشريحة شقة. ملاحظة: للحصول على المجهر STED، جبل مع إطالة الذهب. استخدام 30 ميكرولتر من إطالة الذهبدون دابي والسماح لعلاج بين عشية وضحاها. ختم بطلاء الأظافر غير ضرورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض الشرائح التي widefield المجهر epifluorescence مع 40 أو الهدف 100X باستخدام فلتر مجموعة مناسبة للدابي على التركيز. اختياريا تخزين الشريحة في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة عدة أسابيع. لا تجمد. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalized for each spheroplast sample by direct observation of lysis with a light microscope. To the trained eye, round spheroplasts darken as they swell before lysis; after lysis cellular remnants appear as floating &#8220;ghosts&#8221;. The combination of experimentally optimized reagent concentrations, and inter-sample standardization of timing, yields consistently well-spread nuclei. 
The choice of fluorophore and microscope used to visualize spread chromosomes depends on the desired structure. In general, spread nuclei are very thin (about 200 nm or less) and soluble protein is removed by the procedure. Thus, the reduction of out-of-focus fluorescence provided by confocal or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy yields little benefit. In fact, if manual focusing reveals staining in multiple focal planes, the nucleus is likely underspread. Although any fluorophore compatible with the microscope can be used for staining, shorter wavelength fluors will improve spatial resolution. For example, spatial resolution progressively decreases as the same structure is stained with a green (Alexa 488), red (Alexa 594), far-red (Alexa 647), or infrared (Alexa 750) fluor. This relationship should be considered in the planning and interpretation of experiments. If an even greater level of structural detail is desired, a super-resolution microscope is required. The details of the staining procedure required for each of these applications differ from those described above and the appropriate staining protocol should be followed9. 
Finally, although direct spreading of nuclei on microscope slides is relatively easy, spreading on slide-mounted coverslips yields significantly improved resolution as it avoids viewing the chromosomes through a layer of mounting medium that contains a high concentration of glycerol. Mounting coverslips on slides requires more dexterity and patience than spreading on slides, but this extra effort can be worthwhile depending on the type of structures being analyzed.

الخميرة في مهدها خميرة الخباز توفر العديد من المزايا للدراسات الآليات الجزيئية من العمليات البيولوجية، بما في ذلك دراسة البروتينات التي تتحكم في وظيفة كروموسوم. على الرغم من أن هناك مزايا معروفة من مهدها الخميرة للدراسات الجينية والجزيئية والكيمياء الحيوية، ودراسات الخلوي لتوزيع البروتينات في نواة الخلية معقد بسبب صغر حجمها. نواة الخميرة النموذجية التي يبلغ قطرها ميكرون أقل من واحد، هو فقط حوالي 5 أضعاف الحد قرار من الضوء المرئي. وهكذا، فإن كمية المعلومات حول توزيع البروتينات النووية التي يمكن الحصول عليها من المناعية التقليدية أو باستخدام علامات بروتين فلوري، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، محدودة. نهج مفيد لتميز توزيع النووية الدقيقة من البروتينات السطحية كروموسوم الانتشار. هذا النهج ينطوي على إزالة جدار الخلية، وتعطيل الخلايا والأغشية النووية، والنماذج التالية محتويات غير قابلة للذوبان من نواة ليستقر على سطح شريحة المجهر. وتشمل هذه المكونات غير القابلة للذوبان المصفوفة النووية والكروموسومات. بالإضافة إلى السماح إزالة محتويات النووية القابلة للذوبان، التي تعزز من القدرة على الكشف عن لونين البروتينات ملزمة، الكروموسوم نشر نتائج الأسلوب في الضغط كبيرا من الكروموسومات مثل أن انتشار نواة لها أقطار حوالي 3-5 ميكرون (لنوى الانتصافي مضاعفا) و 2-3 ميكرون لنوى الإنقسامية مضاعفا. هذا الضغط يسمح الكشف عن التحتية النووية التي من الصعب نسبيا أو المستحيل حلها في نواة سليمة. والقصور الواضح للكروموسوم نشر هو إمكانية أن الإجراء قد نشر جزئيا أو كليا يعطل بنية الفائدة. ومما يثير القلق بشكل خاص هو أن كروموسوم ملزمة بروتين معين قد تضيع نتيجة لهذا الإجراء الانتشار. هذا شو المضاعفات المحتملةأن تبقى دينار في الاعتبار عند تفسير البيانات. مثال واحد من البروتين التي تعتبر حساسة لإجراء نشر هو بيتا تويولين. تحت بعض الظروف، المغزل، التي تتألف أساسا من تويولين، يتم الاحتفاظ خلال نشر 3. التصور من المغزل في كثير من الأحيان من المفيد تنظيم نوى الفائدة. ومع ذلك، تصور تويولين يتطلب العلاج مع تثبيتي تركيز عال. يتم فقدان مغزل وفقا للشروط القياسية الموضحة أدناه. يوضح هذا المثال، عند تحليل توزيع بروتين لم يسبق توصيفها، من المهم أن تختلف تركيز تثبيتي لتحديد مدى حساسية البروتين هو هذا الاختلاف. على الرغم من القلق بشأن تأثير الظروف نشر على بنية الصبغي، فقد ثبت فائدة وقوة الأسلوب تنتشر في العديد من السياقات ولها فائدة واسعة في توصيف الإنقسامية، وخصوصا الخلايا الانتصافي 4-7. TWس استخدمت أساليب نشر على نطاق واسع. أول هذه الطرق، التي وضعتها تسريحة وجيرو 8، ويتجنب استخدام المنظفات ويمكن أن تسفر عن منتشرة الاستعدادات التي يبدو أن لها نسبيا المحفوظة جيدا التشكل كروموسوم عندما الملون لDNA محددة صبغ دابي. ومع ذلك، وهذه الطريقة من الصعب نسبيا لاتقان وجودة انتشار نوى يختلف بشكل كبير، وعندما تتم مقارنة منطقة واحدة من الانزلاق إلى مناطق أخرى. هذه المشكلة يمكن أن يعقد النهج الكمي التي تنطوي على تصوير العديد من الأنوية غير محددة من شريحة واحدة لتجنب الحصول على البيانات التحيز. الكروموسوم الثاني نشر الطريقة، التي وضعتها LOIDL وكلاين 1، ينطوي على موازنة التثبيت بواسطة امتصاص العرق، مع تحلل وإزالة الضغط لونين التي يروج لها حل المنظفات. عندما أدائها على الوجه الصحيح، وهذا الأسلوب يعطي نتائج استنساخه جدا مع أقل التباين من منطقة إلى منطقة مقارنة لطريقة تسريحة وجيرو. ويركز هذا العرض على modifieنسخة يوميا من طريقة LOIDL وكلاين، بسبب موثوقيتها والبساطة. كروموسوم نشر ليست معقدة أو تستغرق وقتا طويلا. ما يصل الى 100 الشرائح يمكن أن تكون على استعداد لالمناعية في يوم واحد. وعلاوة على ذلك، قد يتم تخزين انتشار الاستعدادات في الثلاجة لسنوات قبل المناعية، وبالتالي مختبرات يمكن أن تتطور مستودعا للهوامش كروموسوم المجمدة التي يمكن استخدامها عندما تنشأ أسئلة البيولوجية الجديدة أو أصبح الكواشف تلطيخ الجديدة المتاحة. يتم استخدام طريقة كروموسوم نشر الأكثر شيوعا في تركيبة مع المناعية وwidefield مضان المجهر، ولكن من الممكن أيضا لإعداد الشرائح لسوبر قرار ضوء أساليب المجهرية مثل استنزاف الانبعاث المستحث (STED) المجهري.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&amp;nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&amp;deg;C until ready for use.</td></tr><tr><td>Lipsol&amp;nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&amp;nbsp;</td><td>no longer commercially available</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standard coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-E or 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>High resolution coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&amp;deg;C for up to a month.</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media with DAPI</td><td>Vector&lt;br/&gt; Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&amp;deg;C. Also, use as a wet chamber.</td></tr><tr><td>Cardboard slide box</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Use as a wash basin for slides.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

ظهور انتشار نوى يعتمد بشكل حاسم على التوازن بين تثبيت كروموسوم وإزالة الضغط. حتى عندما يتم متوازنة الكواشف بشكل صحيح، يمكن أن يحدث الاختلاف في درجة كروموسوم دي الضغط في مناطق مختلفة من نفس الشريحة و / أو بين الشرائح المختلفة. وبالتالي، ينبغي تقييم نوعية ينتشر في منطقة معينة من الانزلاق قبل أن يتم تفسير الصور. آثار &quot;overspreading&quot; و &quot;underspreading&quot; يمكن توضيح باستخدام أجسام مضادة ضد بروتينات إعادة التركيب الانتصافي. في الشكل 1، نوى الانتصافي هي immunostained لاثنين من البروتينات حقيقية النواة الصرف حبلا Rad51 وDmc1 ومكافحة الملون لDNA مع دابي مزدوجة. وترد مثالين من انتشار الأمثل نوى في الشكل 1A. ويبين الشكل 1B مثال على نواة underspread وأمثلة الشكل 1C من نواتين تتغطى. ملاحظةأن بؤر أقل من Rad51 وDmc1 ويلاحظ في كل أنحاء وunderspread نوى مقارنة لنشر صحيح نوى. في حالة نوى underspread، بعض البؤر هي من التركيز لأن العينة ليست مسطحة بما فيه الكفاية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسهم حاتمة الوصول إلى عدم الكشف عن كافة البؤر. وعلاوة على ذلك، فإن قطره أصغر من انتشار يمكن أن يحول دون قرار من الهياكل متباعدة عن كثب. في حالة نوى تشعبت، البروتين يمكن أن تضيع بسبب عدم كفاية التثبيت و / أو العلاج المنظفات المفرطة. يمكن أن الاختلافات في الطريقة القياسية تجنب استخدام Lipsol. النسخة الأصلية من طريقة نشر صفها LOIDL وآخرون. يجعل من استخدام Lipsol، مختبر الأواني الزجاجية اللياقة المنظفات 1. على الرغم من أن يتم استخدام هذه المنظفات حاليا لكروموسوم ينتشر في العديد من المختبرات، الصيغة الأصلية لم تعد متوفرة تجاريا وتم المنتجات التي تباع حاليا تحت هذا الاسم إعادة صياغتها. Furthermore، الصيغة الأصلية لLipsol هي أيضا غير متوفرة (فرانز كلاين، اتصال شخصي). في محاولة للتغلب على هذه المشكلة، أجرينا التجارب التي استخدمت المتاحة تجاريا ومحددة كيميائيا NP40 المنظفات في مكان Lipsol. تم العثور على هذا التعديل للبروتوكول قياسي لتعطي نتائج مرضية للتجربة التي انتشرت كانت ملطخة نوى الانتصافي لRad51 وZip1، وهو مكون من المنطقة الوسطى من المشبكي الخيطي معقدة (الشكل 2A). ومن المثير للاهتمام، ليحل محل الحل Lipsol مع نفس الحجم من درهم 2 0 أسفرت أيضا نتائج مرضية (الشكل 2B). على الرغم من أن هذه النتائج تشير إلى أن طريقة انتشار المذكورة أعلاه يمكن أن تستخدم بنجاح دون Lipsol، فمن الممكن أن بعض النتائج المذكورة سابقا تعتمد على استخدام Lipsol ولن تكون قابلة للتكرار إذا تم استخدام NP40 أو H 2 0 في مكانها. فرد تعلم نشر ميل طريقةGHT اختيار معقول للبدء باستخدام NP40 و / أو H 2 O في مكان Lipsol. في حال أن الصعوبات التي واجهتها، يجوز للمحقق أن يطلبوا قسامة من Lipsol من المختبر أن حصل على مخزون من الكاشف قبل وقفها. كان Lipsol غير مكلفة والحد الأدنى للمبلغ واحد يمكن أن تأمر كان كافيا لتوليد الملايين من الشرائح. طريقة نشر هو مناسب للاستخدام مع فائقة الدقة أساليب المجهر الضوئي. ويتكون المجمع المشبكي الخيطي اثنين محوري / العناصر الجانبية الخطية كل منها ينظم زوج من الصبغيات الشقيقة إلى مجموعة من المصفوفات حلقة، مع قاعدة كل حلقة متجهة إلى عنصر. الكروموسومات طور التثخن وsynapsed أزواج من العناصر الجانبية التي عقدت بالتوازي على مسافة 100 ميل بحري من البروتينات التي تشكل المنطقة الوسطى من مجمع المشبكي الخيطي. لا يمكن حل هذه العناصر الجانبية المقترنة بالرمز التقليدي widefield المجهر epifluorescence، ولكن يمكن حلها فائقة resoluطرق نشوئها. في الشكل 3، يظهر نواة طور التثخن التي اتسخت مع نفس الأجسام المضادة لبروتين Zip1، وتستخدم للتجربة في الشكل 2. كانت ملطخة العينة أيضا للبروتين Red1، وهو مكون من محوري / العناصر الجانبية. نتيجة تكشف أن الأجسام المضادة Zip1 يعترف المنطقة ملزم عنصر الوحشي Zip1، بدلا من حلزونية ألفا ممدود لف لفائف المجال الذي يكمن بين عنصر ملزم المناطق الجانبية. وبالتالي، فإن نمط تلطيخ لوحظ مع هذه الأجسام المضادة Zip1 يكشف عن مسارات متوازية من العناصر الجانبية المقترنة. توزيع Red1 بؤر العناصر على طول الجانبية متناثر نسبيا مقارنة Zip1 البؤر، ولكن يبين طريقة تلوين المزدوج الذي Red1 بؤر الكذب عادة بالقرب من مسارات خطية يحددها Zip1 البؤر. هذه النتائج تتفق مع الأعمال السابقة التي كانت تستخدم نفس الأسلوب نشر لإعداد عينات لتحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني. الهيكل الثلاثي للشركات المشبكي الخيطييتم الاحتفاظ ليكس أثناء إجراء الانتشار. تم إنشاء الصورة هو مبين في الشكل (3) من قبل STED المجهر 9. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig1.jpg" /> الشكل 1: أمثلة من انتشار نوى نوى الانتصافي الملون لDmc1 (الأخضر)، Rad51 (الحمراء)، والحمض النووي (دابي والأزرق). شريط = 1 ميكرون. (A) 2 أمثلة لنشر الأمثل النوى. (B) مثال نواة underspread. (C) مثالان من نوى تتغطى. على سبيل المثال على اليسار هو نواة التي يتم تتغطى فقط الجزء العلوي. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig2.jpg" /> الشكل 2: نوى الانتصافي أعدت دون استخدام Lipsol انتشار نوى الانتصافي من المراحل المشار إليها الملون لRad51 (الحمراء).Zip1 (الأخضر)، والحمض النووي (دابي والأزرق). لاحظ أن الضغط الصبغي الذي يحدث مع الخلايا الانتقال من طور الخيوط النحيلة لpachynema يتم الاحتفاظ بشكل كبير. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig3.jpg" /> الشكل (3): تصور مجمع المشبكي الخيطي عبر STED المجهر نواة طور التثخن الملون لZip1 (الخضراء) وRed1 (الحمراء). تم معالجة البيانات باستخدام البرنامج المساعد DeconvolutionLab يماغيج 10 لتشغيل 100 تكرارات باستخدام نموذج ريتشاردسون-لوسي مع STED PSF قياسه.

Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Views.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Video: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>تصور عضيات الخميرة بعلامات البروتين الفلوري

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

تصور عضيات الخميرة بعلامات البروتين الفلوري

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Biochemistry

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Immunology and Infection

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

تصور عضيات الخميرة بعلامات البروتين الفلوري

تصور عضيات الخميرة بعلامات البروتين الفلوري

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية